从混杂的微生物群体中获得单一菌株的方法称为分离纯化。分离纯化可采用琼脂平板划线分离法、倾注平板法、平板表面涂布法等。需要注意的是，一次分离纯化操作得到的单菌落并不一定保证是单一菌株，因此，单一菌株的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜观察个体形态特征后才能确定，有些微生物要经过多次分离纯化过程才能得到单一菌株。

(一)琼脂平板划线分离法

平板划线有多种方法，其目的都是要将细菌分开，培养后可观察单个菌落的特征，有斜线法、曲线法、方格法、放射法和四格法，如图4-2所示。现主要介绍常用的分区斜线划线法：烧灼接种环，待冷，取一接种环菌液。左手斜持平皿，靠近火焰周围，右手握持沾菌的接种环伸入皿内平行划线，划线范围占平板的1/3～1/5；完成第一区域的划线后，旋转平板，在平板另1/3～1/5面积内作连续平行划线，如果菌液中菌体数量很多，划完第一区域后需要灼烧接种环；如此重复3～4次，以达到培养后能获得单个菌落的目的。

图4-2 平板划线法
a.斜线法b.曲线法c.方格法d.放射法e.四格法

(二)倾注平板法

本法常用于菌落总数测定、细菌对药物的敏感度试验以及药物的含量测定等。倾注平板的常用操作方法有以下两种：

1.菌液混入培养基法 用无菌吸管吸取定量菌液，加入已熔化并冷却至约50℃的琼脂培养基中，迅速混匀，倒入无菌平皿，使其均匀布满皿底。平置勿动，凝固后即成含菌平板。此法细菌分布均匀，药物的抑菌试验(药敏试验)多用此法制备含菌平板。

2.菌液先加入平皿法 以无菌吸管吸取定量菌液或其他含菌样品，加入无菌平皿中，再将熔化并冷却至约50℃的无菌琼脂培养基倾入该平皿中，立即将平皿轻轻地旋转晃动，以使菌液与培养基混合均匀，平置待凝固。计算药品、食品等样品中菌落总数时常用此法。由于是将定量样品直接加入平皿中，所以菌落数较准确。

(三)平板表面涂布法

由于将含菌材料加到还比较烫的培养基中再倒平板容易造成某些热敏感菌的死亡，而且倾注平板法也会导致一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响生长，这种情况下就需要采用平板表面涂布法。其做法是将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面上，再用无菌涂布棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落。