由于细菌体积小且透明，活体细胞内又含有大量水分，因此，对光线的吸收和反射与水溶液相差不大。当把细菌悬浮在水滴内，放在显微镜下观察时，由于与背景没有明显的明暗差，难于看清它们的形状与结构，为了更好地看清微生物的形态结构，就必须对它们进行染色，这样就可在普通光学显微镜下清晰地观察到微生物的形态结构。因此，微生物染色技术是观察微生物形态结构的重要手段。但是，染色观察时必须注意，染色后的微生物标本是死的，在染色过程中微生物的形态结构可能会发生一些变化，不能完全代表其活细胞的真实情况。

微生物染色法根据染色原理和染液的不同分为多种类型，下面将对一些常用染色方法做一个简单介绍。

(一)革兰式染色法

革兰氏染色法是使用最广泛的一种鉴别染色法，是细菌分类和鉴定的重要性状。它是1884年由丹麦医师Gram创立的。革兰式染色法不仅能观察到细菌的形态，还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用G+表示；染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌，用G-表示。

革兰氏染色的主要过程：初染(结晶紫，30s)→媒染剂(碘液，30s)→脱色(95%乙醇，10～20s)→复染(番红，30～60s)。

革兰氏染色的不同反应是由于它们细胞壁的结构和成分不同而造成的。通过初染操作后，细菌细胞膜或原生质体染上了不溶于水的结晶紫与碘的大分子复合物。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在用乙醇洗脱时，肽聚糖网孔因脱水而明显收缩，使通透性降低，结晶紫与碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色。反之，革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低、交联松散，而脂类物质含量高，用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫与碘的复合物极易被溶出细胞壁而脱色，再经番红等红色染料进行复染时，就使革兰氏阴性细菌获得了一层新的颜色—红色。

注意事项：

(1)革兰氏染色法成败的关键是乙醇脱色。如果脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如果脱色时间过短，革兰氏阴性菌因脱色不完全也会被误判成阳性菌。脱色时间的长短还受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌做练习，以掌握脱色时间。

(2)染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。

(3)选用幼龄的细菌，若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。一般革兰氏阳性菌培养12~16h，革兰氏阴性菌培养约24h。

(4)脱色时冲洗的液体，一般可直接冲入下水道，烈性菌的冲洗液必须冲在烧杯中，经高压灭菌后方可倒入下水道。

(二)芽孢染色法

芽孢是某些细菌生长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，能否形成芽孢以及芽孢的着生位置、形状与大小是鉴定细菌种类的重要依据之一。细菌芽孢含水量很低，具有厚而致密的壁，其通透性比营养细胞低，用一般染色方法难以着色。必须用着色力强的染色剂，并加热以促进芽孢着色，脱色时菌体上的颜色被脱掉，而芽孢上的染料则难以渗出，故仍保留着原有颜色，然后用另一种反差强烈的染料复染，使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，明显地衬托出芽孢来，具体方法很多，如孔雀绿-番红染色法等。

(三)鞭毛染色法

细菌鞭毛极细，其直径一般为10~20nm，一般不能用普通光学显微镜直接观察，只有用电子显微镜才能观察到。但是若采用特殊染色法，染色前用媒染剂处理，使媒染剂大量沉积在鞭毛上，让鞭毛直径变粗，再进行染色，则在普通显微镜下也能看到。鞭毛染色法有很多种，但基本原理相同，常用的媒染剂是由单宁酸和钾明矾或氯化铁等配制而成的一种不太稳定的胶体溶液，而染料可根据不同的方法有多种选择。

(四)荚膜染色法

荚膜是由多糖类衍生物和多肽聚集而成的，能溶于水，且自身含水量很高。因此，对荚膜染色时不宜用水冲洗，也不宜加热固定，因为加热固定后细胞易失水而收缩变形。由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法对荚膜染色，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色。因此，荚膜在菌体周围呈现一个透明圈，从而可以清晰地观察到荚膜的大小和形态。荚膜染色法主要有番红染色法、湿墨水法、干墨水法、Tyler法等。

文章来源：《农产品质量安全检测》

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