微生物具有容易变异的特性，因此，在保藏过程中，必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态。低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素，因此，菌种保藏方法虽多，但都是根据这3个因素而设计的。国际国内常用的菌种保存方法包括传代培养法、液态石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、-80℃冰箱冻结法、液氨超低温冻结法。

(一)传代培养保藏法

将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上或穿刺接种于半固体培养基(细菌；营养琼脂；真菌：PDA；乳酸菌：MRS培养基；厌氧菌：庖肉培养基；嗜盐性弧菌：含3% NaCl的TSA或营养琼脂)，在适宜的温度下培养，待充分生长后，移至2～8℃的冰箱中保藏。棉塞部分用油纸包扎好，使微生物在低温下维持很低的新陈代谢，缓慢生长，当培养基中的营养物被逐渐耗尽后再重新移植于新鲜培养基上，定期移植的间隔时间依微生物的种类而有不同，霉菌、放线菌及有芽孢的细菌保存2～4个月，移种一次。酵母菌2个月移种一次，细菌最好每月移种一次。

此法为实验室和工厂常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异，因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状，污染杂菌的机会也较多。

(二)甘油管保藏法

取细菌培养物于保存管中，按1：1的体积比例加入40%灭菌甘油，振荡使甘油分布均匀，密封，在液氮中冻结后再转至-20℃或-80℃长期保存。

(三)液态石蜡保藏法

液态石蜡保藏法是建立在传代培养保藏法之上的，能够适当延长保藏时间。将菌种斜面接种或半固体穿刺接种，待其充分生长后，以无菌操作将灭菌液态石蜡加入，加入的量以高出斜面顶端或半固体培养基表面1cm为准，使菌种与空气隔绝。棉塞外包牛皮纸或换上无菌橡皮塞，将试管直立放置于低温或室温下保存(有的微生物在室温下比冰箱中保存的时间还要长)。石蜡油的灭菌除水：将液态石蜡分装于三角烧瓶内，塞上棉塞，并用牛皮纸包扎，121℃灭菌30min，连续灭菌2次，然后在40℃温箱中放置2周(或置于105～110℃烘箱中烘2h)，使水汽蒸发掉，除净水分的石蜡油呈均匀透明状液体。

此法实用，且效果好。霉菌、放线菌、芽孢细菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏1～2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。此法的优点是制作简单，不需特殊设备，且不需经常移种。缺点是保存时必须直立放置，所占位置较大，同时也不便携带。

注意事项：

(1)温度。根据菌株特性在适宜的温度下保藏。如副溶血弧菌、创伤弧菌等致病弧菌，室温(21～23℃)保存，不能冷藏。

(2)氧气。根据菌株特性保藏在相应的氧气环境中，如厌氧环境、微需氧环境。

(3)当用液态石蜡保藏法时，应对需保藏的菌株做一定的预实验，因为某些菌株能利用石蜡为碳源，还有些菌株对液态石蜡保藏敏感。

(四)液氮冷冻保藏法

(1)准备安瓿管。用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂，因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，安瓿管的大小通常使用75mm×10mm的或能容1mL液体的。

(2)加保护剂。当灭菌保存细菌、酵母菌或霉菌孢子等容易分散的细胞时，将空安瓿管塞上棉塞，121℃灭菌15min；若作保存霉菌菌丝体用，则需在安瓿管内预先加入保护剂，如10%的甘油蒸馏水溶液或10%二甲亚砜蒸馏水溶液，加入量以能浸没以后加入的菌落圆块为限，而后再用121℃灭菌15min。

(3)接入菌种。将菌种用10%的甘油蒸馏水溶液制成菌悬液，装入已灭菌的安瓿管；霉菌菌丝体则可用灭菌打孔器，从平板内切取菌落圆块，放入含有保护剂的安瓿管内，然后用火焰熔封。浸入水中检查有无漏洞。

(4)冻结。将已封口的安瓿管以每分钟下降1℃的慢速冻结至-30℃。若细胞急剧冷冻，则在细胞内会形成冰的结晶，因而降低存活率。

(5)保藏。将冻结至-30℃的安瓿管立即放入液氮冷冻保藏器的小圆筒内，然后再将小圆筒放入液氮保藏器内。液氮保藏器内的气相温度为-150℃，液态氮内温度为-196℃。

(6)恢复。培养保藏的菌种需要用时，将安瓿管取出，立即放入38～40℃的水浴中进行急剧解冻，直到全部融化后，再打开安额管，将内容物移入适宜的培养基上培养。此法除适宜于一般微生物的保藏外，也可长期保藏一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物(如支原体、衣原体、氢细菌、难以形成孢子的霉菌、噬菌体等)，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。

(五)瓷珠保藏法

该法操作极为简单，近些年得到了非常广泛的应用，适合实验室菌种的短期或中期保藏。菌种保存管主要由保存液、保存管和小瓷珠3个部分组成，保存管可耐-197℃低温，保存管内装25个左右多孔小瓷珠，该小瓷珠表面多孔，细菌可以很方便地吸附在上面。菌种保存液特别添加了冻存保护液，使菌株免受溶液和冰晶损伤。操作过程如下：

(1)从细菌纯培养物中挑取新鲜培养物接种于菌种保存管中。

(2)拧紧保存管，来回颠倒4～5次，使细菌乳化，不能旋摇，弃掉管中液体。

(3)把保存管放入冰箱保存(-20～-70℃)。

文章来源：《农产品质量安全检测》

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