1.2.1.7 分析条件的选择

(1)提取净化条件的选择

1)提取溶剂的选择

β-兴奋剂的提取方法主要有液液提取法和固相提取法(SPE)。除饲料中因直接添加β-兴奋剂外，β-兴奋剂在生物体内经过吸收、转化、代谢，部分β-兴奋剂可能成为结合型，如与葡糖苷酸酶、硫酸酯蛋白相结合。Boyd等l曾做过对比试验，比较有无酶水解步骤对沙丁胺醇测试结果的影响，结果发现，酶水解后所测得的结果明显高于未水解的(采用RIA方法测试)，有40%～45%沙丁胺醇是以结合物形式存在于肝样品中。而Haasnoot等山报道，费诺特罗在尿样中大约85%是以葡糖苷酸酶化-硫酸酯蛋白化结合物形式存在，但是对于克伦特罗没有数据证明是以结合的形式存在。

水解主要包括酸解和酶解。酶制剂本身及其水解的样品往往可产生大量干扰物质，且酶解条件受酶种类、样品基质及水解条件不同而有所不同，而酸解的分析结果与酶解相近，且产生的干扰物质较少。本方法采用酸解方式进行水解，除使可能以结合态形式存在的化合物游离出来外，同时也使样品基质分散，便于提取。

样品中β-兴奋剂常见的提取溶剂有甲醇、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、乙酸乙酯-异丙醇、乙酸乙酯-正丁醇等。本方法结合12种β-兴奋剂不同的极性，采用不同比例的乙酸乙酯-异丙醇进行提取(添加水平5.0ug/kg，提取一次)，结果见表1-6，如果提取溶剂中异丙醇比例过高，会出现不容易分层，而且浓缩不干的情况，所以，本实验中采用15mL乙酸乙酯-异丙醇(4+6，v/v)提取一次后，再采用10mL乙酸乙酯-异丙醇(7+3，v/v)进行提取，提取回收率比较好，而且容易操作。

表1-6不同比例的乙酸乙酯-异丙醇混合溶剂对β-兴奋剂的提取回收(添加水平5.0ug/kg)

2)pH的选择

根据β-兴奋剂在酸性情况下溶于水溶液，在碱性情况下溶于有机溶剂，本实验中将12种β-兴奋剂在不同pH的乙酸钠缓冲液(0.2mol/L)用乙酸乙酯-异丙醇(4+6，v/v)进行提取，得到结果见图1-6(添加水平10.0ug/kg)，因此本方法中调节pH为9.4～10范围内进行有机溶剂的提取，提取效率对12种β-兴奋剂都较为稳定。

图1-6 β-兴奋剂在不同pH的提取回收情况

3)净化方法

β-兴奋剂最常用的净化手段是固相萃取法(SPE)、免疫亲和色谱法(IAC)和液液净化法等。常用于β-兴奋剂提取的固相柱有硅藻土、C2、C8、C18、硅胶、强阳离子交换柱和弱阳离子交换柱等，所用的SPE柱有Bond Elut C18柱、C18和硅酸柱、酸洗硅酸柱、Bond-EIm Certify柱、Clean screen DAU cartridge柱等，也有用C18柱与SCX离子交换树脂串联的净化方法。本方法采用C18与SCX结合性质的Oasis MCX固相萃取柱，取得了良好的净化效果，并比较了Oasis MCX与SCX的洗脱曲线，见图1-7。从图1-7中可以看出，至少要6mL 5%氨水甲醇溶液才能完全洗脱SCX柱上的沙丁胺醇。因此，实验中采用5%氨水甲醇溶液5mL洗脱，12种β-兴奋剂都取得了较好的回收率。

4)过滤膜的影响

取含12种β-兴奋剂的标准溶液分别过0.22um有机相和水相滤膜，发现有机相滤膜对克伦特罗，妥布特罗有明显的吸附作用，而过水相滤膜基本上没有损失，因此本方法采用过水相滤膜后进样。

图1-7 12种β-兴奋剂在MCX与SCX固相萃取柱上的洗脱曲线
洗脱溶剂：5%氨水甲醇溶液，1～3为淋洗液，4～12为洗脱液

5)基质干扰实验

因上样液中的杂质对β-兴奋剂药物的检测有一定基质效应，所以本方法中的标准曲线都是以空白基质的提取液来稀释和配置的。

(2)仪器条件的选择

1)内标法和外标法的比较

由于所分析的12种化合物的结构差异比较大，研究中对内标法和外标法定量进行了比较，由于尚不能获得12种化合物的同位素内标，本方法采用莱克多巴胺、克伦特罗、沙丁胺醇三种同位素内标，实验证明内标法定量准确性明显高于外标法，尤其是对沙丁胺醇和特布它林这种绝对回收率较低的药物，回收率明显改善，这主要是由于同位素内标能很好地校正方法过程中的损失，以及基质带来的干扰和影响。因此，选择内标法定量。

2)检测条件的确定

按照质谱测定的一般要求，先对各化合物进行全扫描，随后对每个化合物确定扫描离子，采用选择离子模式以提高其检测灵敏度。选择两对离子进行MRM监测即可满足，其中母离子和子离子按照每种化合物的质谱图和结构特性选取。

在所分析的化合物中，各物质极性强弱不同，如特布它林、沙丁胺醇等含有极性较强的酚羟基官能团，而克伦特罗和莱克多巴胺极性相对较弱，因此需要采用梯度洗脱方式来进行分离。试验证明，在梯度洗脱条件下这12种物质均能较好分离。