15.2.1.7 分析方法的选择

(1)样品处理方法

1)卡巴氧原形药的提取方法

卡巴氧在水和丙酮等极性溶剂中溶解性差，文献中通常选择甲醇-水溶液作为组织提取液，溶液中不可避免地含有大量水溶性蛋白和色素等杂质，这些杂质成分复杂并带有颜色，使提取液混浊，严重影响定性与定量效果，同时污染色谱柱。在选择提取液的试验中，试验发现甲醇-水溶液对卡巴氧提取效果不如乙腈，为此，本研究分别使用乙酸乙酯、乙腈以及二者混合液进行样品提取，试验数据表明，以乙腈作为提取液回收率普遍较低，只有40%~50%；而采用乙酸乙酯-乙腈(1+1)混合溶剂的提取效果最佳，既能达到满意的回收率，又能减少弱极性杂质的干扰。为此，本研究采用乙酸乙酯-乙腈(1+1)混合溶剂为提取液，在提取前加入中性氧化铝于样品中，提取过程用正己烷脱脂，以减少脂肪的干扰。提取溶液经减压旋转蒸发至干，定容，LC-MS/MS检测。

2) 代谢产物DCBX、QCA和MQCA的提取方法

DCBX、QCA和MQCA等代谢物在动物体内与蛋白质以结合态存在，通常可采用酸水解、碱水解或酶解的方式将目标化合物与蛋白组织分离，其中酶解的效果最好，不仅反应条件最温和，且与动物组织分离最为彻底。文献报道温度和pH值对酶的生物活性影响极大，本实验方法选用Protease蛋白酶进行酶解，Protease在pH8.5、温度47℃时活性最强。酶解之前，先在样品中加0.6%的甲酸溶液，置于47℃空气浴中1h，使动物组织中天然存在的酶失活；然后用Tris缓冲溶液调节pH，加入Protease蛋白酶，置于47℃空气浴中过夜(16～18h)。

在样品溶液中加入0.3mol/L HCI，使酶解液酸化后，采用阴离子交换固相萃取柱进行净化，本研究对比了Bond Elute Certify II 和Oasis MAX两种商用SPE柱的效果，结果表明Oasis MAX的净化效果和回收率优于前者，本研究对固相萃取所用溶液、流速控制、淋洗和被测物的洗脱等条件进行优化，根据化合物性质，DCBX、QCA和MQCA需要分两步洗脱，第一步用二氯甲烷洗脱DCBX，第二步用含2%甲酸的乙酸乙酯洗脱QCA和MQCA。

(2)液相色谱条件

1)色谱柱的选择

比较了Phenomenex Luna C18、Waters Atlantis dC18以及Inertsil ODS-3等不同填料色谱柱的分离效果，结果表明，使用Inertsil ODS-33um，2.1×100mm色谱柱时，各化合物的出峰时间、分离度和峰形较好。

2)流动相的选择

质谱采用正离子模式进行检测时，通常使用有一定酸度的流动相，以使被分析物容易质子化带上正电荷，从而提高检测的灵敏度，本实验比较了0.05%～0.3%的甲酸溶液，结果表明，使用0.1%的甲酸溶液作为流动相各组分得到比较好的分离，并且质谱上有较强的响应，故实验选择0.1%的甲酸溶液作为流动相。另外，流动相体系还包括甲醇和乙腈，采用梯度洗脱，柱温30℃，进样量30 μL。

(3)质谱条件

动物组织的成分复杂，样品基质容易对目标分析物产生干扰，本研究采用电喷雾离子源(ESI)和正离子扫描方式进行LC-MS/MS检测，多反应监测模式(MRM)能有效的消除样品基质的干扰，大大提高方法的灵敏度。为了消除样品基质对离子化的抑制作用，在标准溶液和测试样品溶液中都加入已知量的内标QCA-d4。选取丰度最强的离子作为各组分的监测离子，通过对质谱条件进行优化，使每种化合物的分子离子与特征碎片离子的例子对强度达到最大，四种化合物选定的质谱条件为：离子源温度： 450℃； NEB： 8.00； CUR： 7.00； CAD： 5.00； IS： 5000.00； EP： 10.00。

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