5.1.4.2测定

β-内酰胺类药物的残留检测方法已有大量报道，主要有微生物检测法、免疫检测法、色谱法以及色质联用法，而色谱法主要包括液相色谱法(LC)、气相色谱法(GC)和薄层色谱法(TLC)等。免疫检测法的优点在于费用相对较低，便于使用，方便携带，适合现场开展工作，具有高选择性和灵敏度，具有很大的发展前景；而微生物法和理化检测法则较为成熟。20世纪90年代以后，在β-内酰胺类药物残留分析方法中LC法占绝对优势，并随着质谱技术的发展，色质联用仪器的逐步普及，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术以其选择性好、灵敏度高、分析速度快、不需衍生化、可同时定性定量等优点成为目前β-内酰胺类药物残留分析中最主要的手段。

(1)微生物法

微生物法是建立在抗生素能抑制细菌生长原理的基础上，能简单快速地测定所有抗生素残留的一种筛选检测技术。这些传统检测方法的主要优点是廉价，易于操作和适于大量样品的筛选，但所需时间长，显色状态需通过肉眼判断，易产生误差。同时，由于具备抑菌作用的抗生素种类繁多，而动物源食品中干扰物质又多，结果造成假阳性率较高，方法缺乏特异性。Stead等对微生物法测定牛奶中10种抗生素(包括6种β-内酰胺类药物)进行了评价。取100μL牛奶至琼脂平板，经塑料膜密封后放置水浴锅中孵育(64℃)3h，Delvo检测试剂盒判定检测终点。当添加水平在欧盟规定的残留限量水平时，检出阳性结果的正确率为100%。Wachira等使用低成本的微生物方法测定鸡组织中的青霉素G。采用蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌琼脂扩散，在pH7的条件下，在测试板上测定肝脏和肾脏样品中青霉素G的浓度均低于MRL(50ng/g)，且2倍的LOD也低于MRL，可有效地用于青霉素G的常规筛查。Ang等对微生物法和LC法测定牛奶中阿莫西林和氨苄青霉素进行了对比。微生物法操作如下：将样品加至平板孔内，每份样品4个平板，对照样品单独加样。然后将平板置64℃孵育3h，孵育后测定抑菌圈。将10ng/mL设定为曲线的校准点，绘制标准曲线，校准平均值获得药物浓度。结果表明两种方法测定结果一致，但LC法比微生物法灵敏度高。

(2)薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)

TLC在兽药残留的快速筛选检测方面应用广泛，特别是高效薄层色谱法(HPTLC)的斑点原位扫描定量、定性和高效分离材料弥补了常规TLC在灵敏度和重复性方面的不足，还保持了TLC的简便、快速和样品容量大的优点，可使用正相或反相，分辨率几乎与HPLC相当。动物组织中残留的氨苄西林、苄青霉素和苯甲氧基青霉素有采用TLC分析的报道，固定相主要是硅胶或纤维素。除个别学者使用自动射线照相色谱检测闪烁计数器定量外，其他的TLC方法多使用生物抑制法进行检测和定量。这种技术的缺点是操作复杂、时间长、重现性较差，而且炅敏度低，LOD通常为50μg/kg。Grzelak等建立了一种检测牛奶中头孢乙腈、头孢呋辛的TLC分析方法。该方法采用的TLC板为Si 60 F254(10cm×20cm)，分离获得的条带在254nm波长处进行检测。TLC平板用正己烷除去牛奶样品中的脂肪，再用甲醇-甲苯-乙酸乙酯-98%甲酸(5+20+65+10，v/v)作为展开剂，结果显示头孢乙腈回收率为97.66%，头孢呋辛为86.13%。卢英强等建立了一种快速鉴定动物皮肤或肌肉组织中青霉素的TLC方法，将组织匀浆，经0.2moL/L H2SO4酸化，用3倍体积的乙酸乙酯浸泡24h，分离提纯后，置75℃水浴中浓缩。TLC展开系统：氯仿-苯-冰乙酸(2+2+1，v/v)，展开后，室温条件下自然干燥15min，取出层析板，计算Rf值和观察色斑。结果发现，从动物组织中分离提纯青霉素获得的色斑与青霉素标准品色斑和Rf值完全相同，层析色谱清晰。

(3)毛细管电泳法(capillary electrophoresis，CE)

CE具有高柱效、分析时间短、样品范围宽等特点。但由于电渗流的不稳定，CE的重现性较差，且进样量太小，造成检测灵敏度较低。目前，CE已发展出多种不同的分离模式，如毛细管区带电泳(CAE)、胶束电动毛细管色谱(MEKC)、毛细管等电聚焦(CIEF)、毛细管凝胶电泳(CGE)和毛细管等速电泳(CITP)等，使其在抗生素分析中得到快速发展。陈号采用HPCE方法来评价青霉素GIAC柱的柱效。采用涂层石英毛细管柱(50um×60cm)，分离电压18kV，二极管阵列检测器(DAD)检测波长198nm，温度25℃，缓冲液为30mmoL/L硼砂缓冲液(pH3.8)。HPCE检测标准曲线在1～100ug/mL范围内线性良好，青霉素G样品添加回收率为76.38%～94.67%，CV为5.67%～15.91%。朱丹成用CAE测定氨苄青霉素的含量，缓冲液为25mmoL/L硼砂缓冲液(pH7.98)，在4min内出峰，电压以16kV为佳，测定LOD为4mg/L，加样回收率为97.9%～102.4%，RSD小于3%。Santos等采用50.5cm熔融石英CAE，以25mmoL/L磷酸缓冲液(pH6.8)为电泳缓冲液，20min内检测了牛奶中的14种常用CEPs，LOD在0.42～0.16μg/mL之间。姚晔等采用MEKC法分离检测5种β-内酰胺类抗生素。缓冲液为20mmoL/L Na2HPO4-20mmoL/L NaH2PO4(pH8.5)，20mmoL/L十二烷基硫酸钠和体积分数25%甲醇，在18kV电压下5种抗生素在15min内达到基线分离。各组分线性关系良好，LOD为5.3～8.1mg/L，进样精密度RSD为3.8%～5.5%。该研究表明，对分子结构特别相近的抗生素，通过表面活性剂胶束固定相与有机添加剂协同作用来改善分离效果是可行的。Bailon-Perez等采用毛细管电泳-串联质谱(CE-MS/MS)法检测了鸡肉中9种PENs(蔡夫西林、双氯西林、氯唑西林、苯唑西林、氨苄西林、青霉素G、阿莫西林、青霉素V和哌拉西林)残留。鸡肉样品经乙腈提取后，采用OasisHLB柱和氨基柱分别进行净化，CE分离柱为填充硅胶柱(96cm×360μm，50um)，缓冲液为60mmoL/L醋酸铵缓冲液(pH6.0)，离子阱质谱仪(MSn)，ESI电离源，多反应监测(MRM)模式检测。该方法测得鸡肉样品的LOD为8～12μg/kg。

(4)气相色谱法(gaschromatography，GC)

β-内酰胺类药物为强极性、热不稳定性和难挥发性化合物，采用GC测定时，需要进行甲酯化衍生反应来提高其挥发性和降低极性。常用的检测器主要有氮磷检测器(nitrogen-phosphorus detector，NPD)和质谱检测器(mass spectrometry detector，MSD)等。由于GC方法前处理步骤繁锁，目前已很少用于β-内酰胺类药物残留的实际检测。Preu等建立了牛肉中青霉素的GC同位素稀释检测方法。样品经乙腈和磷酸盐缓冲液(pH2.2)提取，NaCl、二氯甲烷和Na2SO4除去水，旋转蒸干后，分别采用石油醚/磷酸盐缓冲液(pH7)、磷酸盐缓冲液(pH7)亿醚、磷酸盐缓冲液(pH7)/二氯甲烷、磷酸/二氯甲烷进行LLP，然后采用阴离子交换柱进行净化，再用磷酸盐缓冲液(pH2.2)/二氯甲烷进行LLP净化，氮吹蒸干后，用重氮甲烷进行衍生化，使用GC-NPD或GC-MS进行检测。采用熔融石英的交联甲基聚硅氧烷胶毛细管柱(30m×0.25mm，0.25um)进行分析，程序性升温模式分离，电子电离(EI)，选择离子(SIM)模式监测。该方法测得青霉素的LOD为3ug/kg。该试验比较了使用不同内标和不使用内标检测青霉素G的区别，发现使用13C同位素内标回收率较好。Meetsehen等用GC测定牛奶和动物组织中7种PENs。用重氮甲烷衍生化，形成易挥发的青霉素甲基酯类化合物，有效提高了检测灵敏度和再现性。采用毛细管柱(30m×0.26mm，0.1um)进行分析，程序升温模式分离，进样体积3μL。方法回收率在46%～73%之间，牛奶和组织中PENs的LOD小于3μg/kg。