8.1.4.1 前处理方法

由于基质复杂，ASs的残留量极低，再加上样品提取和纯化的过程非常繁琐，导致最后的回收率较低，使得样品中ASs多组分残留的检测具有一定的难度。不但要求有高灵敏度的检测方法，而且也需要相应高效的提取和净化方法。一般固体样品需要经过粉碎或冷冻干燥均质化后，在适当条件下水解，将结合态的ASs解离出来，然后经有机溶剂提取和净化后进行分析。

(1) 水解方法

ASs在动物体内常以结合态形式存在，如硫酸酯、葡萄糖醛酸苷等。为提高方法提取效率，必须通过水解使ASs游离出来。水解方法一般有三种:酸解、碱解和酶解。

Rambaud等建立了人头发中ASs多残留的气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)检测方法。样品经磨碎后在50℃条件下用甲醇提取，用甲醇化钠(MeONa)和HCl进行酸性水解后，用乙酸乙酯再次提取，再用NaOH中和，GC-MSMS分析。方法定量限(LOQ)可达0.1～10μg/kg，平均回收率为50%。

Kaklamanos等建立了肌肉组织中的20种ASs的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测方法。样品用含枯草杆菌的pH9.5 Tris缓冲液进行碱水解，叔丁基甲醚提取，55℃旋转蒸干，加入甲醇-水(4+1，v/v)涡动混匀，然后采用正己烷除脂，再用OasisHLB和氨基柱分别进行净化后，LC-MS/MS检测。该方法检测限(CCa)为0.03～0.14ng/g，检测能力(CCβ)为0.05～0.24ng/g。

酶解的作用条件温和，可避免ASs在强酸、高温等条件下被破坏，且由于酶的催化活性，水解效率高，被广泛使用。酶解常采用β-葡萄糖醛酸苷酶和芳基硫酸酯酶，通常在37℃酶解数小时。Marchand等利用气相色谱-质谱(GC-MS)检测了肉中的ASs。冻干样品用甲醇-醋酸缓冲液提取后，通过葡萄糖醛酸酶和硫酸酯酶解离待测药物(52℃孵育15小时，pH5.2)，再用醋酸缓冲液液液分配，过ENVI-Chrom P柱净化后，分别按酚结构药物和D4-3-酮类药物进行衍生化，再用GC-MS分析。该方法测得23种ASs的检测限(LOD)为5～100ng/kg，其方法学指标符合欧盟标准。

(2)提取方法

ASs残留的提取主要采用液液萃取(LLE)的方法。近年来，一些新的提取技术，如微波辅助提取(MAE)、加速溶剂萃取(ASE)、超临界流体萃取(SFE)也开始应用到ASs残留的提取中。

1) 液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

ASs种类较多，残留浓度较低(ng/kg～μg/kg)，且样品基质较为复杂，使残留分析变得较为困难。一般来说，肉、脂肪、肾脏和肝脏常采用有机溶剂进行LLE提取，同时进行研磨、冷冻干燥和匀质，然后进行多步骤液液分配净化或固相萃取净化。一般常以甲醇为提取溶剂，乙腈、乙醚、叔丁基甲醚等也可作为其提取剂。

秦燕等建立了动物肌肉组织中多种ASs的LC-MS/MS分析方法。样品加醋酸缓冲溶液均质，经酶水解后，再加甲醇超声提取，用叔丁基甲醚LLE至少两次后，再用反相固相萃取柱净化，用LC-MS/MS在多反应监测(MRM)模式下定性及定量分析。该方法测得10种ASs的LOQ为0.5～1.0μg/kg，平均回收率为55%～77%，相对标准偏差(RSD)为7.1%～35%。Blasco等建立了肉中ASs残留检测的LC-MS/MS分析方法。样品经酶解后用甲醇提取，然后用C18和氨基柱固相萃取净化，结合使用正离子和负离子切换模式进行质谱分析，方法LOD和LOQ都低于0.5ng/g。Vanhaecke等建立了牛肉中34种ASs(10种雌激素、14种雄激素和10种孕激素)残留的超高效液相色谱串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法。样品经甲醇匀质，正已烷除脂，乙醚LLE后，采用硅胶柱和氨基柱净化。UPLC-MS/MS采用大气压化学电离源(APCI)在正离子和负离子模式下采集数据。该方法的CCa为0.04～0.88μg/kg，CCβ为0.12～1.9ug/kg，日内变异系数(CV)与日间CV均低于20%，线性关系良好(r>0.99)。

徐锦忠等用乙腈提取了鸡肉和鸡蛋中的睾酮、甲基睾酮、群勃龙、去氢睾酮、诺龙、美睾酮、康力龙、丙酸诺龙、丙酸睾酮和苯丙酸诺龙。超声提取后用正己烷液液分配除脂，LC-MS/MS在选择反应监测(SRM)、正离子模式下进行定性及定量分析。方法LOQ为0.5μg/kg，平均回收率为73.4%～108.9%，RSD为3.4%～13.4%。实验比较了乙腈、叔丁基甲醚和乙酸乙酯的提取效率，发现几种溶剂的提取回收率相差不大，乙酸乙酯和叔丁基甲醚提取后脂肪较多，而乙腈提取液中则较少。

曾东平等建立了猪肉中8种性激素(己烯雌酚、甲基睾酮、炔诺酮、17a-乙炔雌二醇、雌二醇、6a-甲基-17a-羟基孕酮、苯甲酸雌二醇和醋酸氯地孕酮)的GC-MS检测方法。样品用乙醚提取，然后使用甲醇-水和石油醚进行液液分配，氮气吹干提取液后，用水和乙醚进行再次提取，然后用氨基固相萃取柱净化，再经衍生化反应后进GC-MS分析。8种ASs的平均回收率大于70%，批内CV为2.7%～12%，批间CV为5.9%～12%；LOD和LOQ分别为0.94～1.92μg/kg、3.13～8.03μg/kg。贺利民等在碱性条件下用叔丁基甲醚提取肌肉组织及鸡蛋中的11种ASs，经过冷冻离心脱脂净化后，LC-MS/MS检测。动物肌肉和鸡蛋中睾酮、甲基睾酮、去氢睾酮、美睾酮及康力龙的LOD是0.3μg/kg，回收率是62.3%～105%，RSD为0.5%～15%；群勃龙、诺龙、丙酸诺龙、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙的回收率大于50%，RSD小于16%。实验比较了甲醇、乙腈、乙酸乙酯和叔丁基甲醚等溶剂或其混合物的提取效果，发现叔丁基甲醚的提取回收率高且易于浓缩。Saeed等在对肉制品中同化激素残留水平调查中，也采用叔丁基甲醚提取，药物经免疫亲和柱净化后，GC-MS检测分析。6种ASs的平均回收率是77%～99%。

2)超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，SFE)

SFE是跟索氏提取法类似的一项技术，区别是提取过程中使用超临界流体作为溶剂，最常用的超临界流体是二氧化碳。这项技术的主要优点是高扩散率、低黏度和较小的表面张力16。Stolker等将SFE应用于动物组织中醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸氯睾酮和醋酸美仑孕酮的检测。采用二氧化碳为超临界流体，氧化铝作为吸附剂来提取待检测化合物。经提取后的激素再进行碱性酶解和衍生化处理，最后上GC-MS分析。方法LOD可以达到2μg/kg，重复性为4%～42%(n=9)，再现性为2%～39%。Din等使用SFE技术提取牛肉中的群勃龙，采用甲醇增加溶解性，并减少基质干扰。用含10%甲醇的二氧化碳在400atm、75℃下提取60min，回收率可达到98%。

3)加速溶剂萃取(accelerated solvent extraction，ASE)

ASE是利用升高温度和压力，增加物质溶解度和溶质扩散速度，提高萃取的效率。与传统提取方式相比，ASE速度快、溶剂用量少、萃取效率高、待测组分回收率好，可实现全自动安全操作。Hooijerink等采用ASE建立了一种检测肾脂肪中6种孕激素(醋酸氟羟孕酮、地马孕酮醋酸酯、醋酸甲地孕酮、氯地孕酮、醋酸美仑孕酮、醋酸甲羟孕酮)的分析方法。ASE装置中装有氧化铝、无水硫酸钠和肾脂肪，混合后，用乙腈进行在线提取，再冷冻除去脂肪，C18固相萃取柱净化，LC-MS/MS进行检测。该方法的CCa为0.3～0.9ng/g，CCβ小于等于2ng/g，回收率为17%～58%。

4)微波辅助萃取(microwave-assisted extraction，MAE)

MAE可加热搅拌样品，有助于提高固体样品的提取效率。同时，MAE提取时间短，可用于替代索式提取法，但仍其需要其他的提取与净化步骤。Wang等采用动态微波辅助提取(DMAE)与盐析液液萃取(SLLE)相结合方法检测鱼组织中9种ASs。该方法提取过程见图8-3。ASs药物在微波辅助下采用乙腈-水提取，乙腈-醋酸铵溶液中进行分配，LC-MS/MS检测。该方法的LOD为0.03～0.15ng/g，回收率为(75.3%±4.9%)～(95.4%±6.2%)。

图8-3 动态微波辅助提取(DMAE)-盐析液液萃取(SLLE)装置流程图

A.盛溶剂(乙腈或水)容器:B.微波；C.萃取容器；D.真空泵；E.真空阀；F.收集管；G真空SPE管；H.流速控制阀

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