(3) 净化方法

为了去除或减少生物样品中的脂肪、蛋白质等其他杂质，并浓缩分析物，提高分析灵敏度，初步提取出来的样品溶液通常需要进一步净化。常见的净化方法包括液液分配(LLP)、固相萃取(SPE)、免疫亲和色谱(IAC)和凝胶渗透色谱(GPC)等。

1) 液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP是一-种初级的净化技术，根据目标物在互不混溶的液体间的溶解度不同，达到富集分离净化效果。虽然LLP需要用大量的有机溶剂，萃取时间长，分离效率低，萃取过程易乳化或沉淀，但仍然在残留分析中广泛应用。目前，LLP已经从简单的一步溶剂萃取发展到用复杂的多相分配体系提取和净化分析物。

江洁等建立了水产品中多种激素的高效液相色谱法(HPLC)。在样品处理方法上，鱼肉采用乙醚进行均质处理后超声振荡，水浴减压蒸干提取液后，加入甲醇进行溶解，再利用石油醚进行LLP萃取脂溶性杂质，离心去除石油醚层，再次蒸干甲醇溶液，加入一定量的水清洗后进行乙醚反萃取，最终浓缩后上样。通过回收率、相对标准偏差的评价，该方法对雌二二醇、睾酮、甲基睾酮及孕酮的测定准确可靠，回收率大于70%，RSD为1.27%～6.92%，LOD为0.05～0.1ug/mL。Vanhaecke等利用甲醇提取牛肉中的34种ASs，正己烷脱脂后再使用二乙醚进行LLP，最后用硅胶柱和氨基柱进行净化。方法LOD可达到0.04～0.88μg/kg，LOQ为0.12～1.9μg/kg。Zeng等建立了猪组织中8种ASs的GC-MS检测方法。样品经乙醚提取，涡动混匀后离心，氮吹蒸干，加入甲醇-水(4+1，v/v)和石油醚，涡动混匀后离心，旋转蒸干至终体积为0.5mL，再加入水，用石油醚进行提取，氮气吹至终体积为0.5mL，然后用氯仿和甲烷进行溶解，硅胶和氨基柱进行净化。在2.5～50μg/kg的添加浓度范围内，方法回收率可达67.7%～120%，批内CV为0.4%～12%，批间CV为6.4%～11%。林奕芝等采用GC-MS测定肉中雌二醇、戊酸雌二醇、炔雌醚和苯甲酸雌二二醇的残留量。样品用乙腈超声提取，提取液经二氯甲烷反萃取后浓缩至干，残留物经固相萃取柱净化后，再进行衍生化反应，在选择离子监测(SIM)模式下用GC-MS测定。该方法4种组分分离较好，LOD小于等于20ng/g，回收率为84.6%～92.4%，CV小于或等于1.2%。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE是一种由液固萃取和柱色谱技术结合形成的样品前处理技术，具有分离效率高、选择性好、有机溶剂用量少，易与各类检测方法联用等优点。ASs残留分析常用的SPE柱种类有C18、HLB、氨基、硅胶、氧化铝、石墨化碳黑(GCB)、氰基柱以及复合用柱等。

A.C18柱

王炼等采用酶水解-HPLC法测定肉及牛奶中的11种ASs。碎肉用乙腈超声提取，水浴蒸干后加入KH2PO4缓冲液(牛奶直接加入KH2PO4缓冲液)，再加β-葡萄糖醛酸酐酶，37℃恒温水解24h，用KH2PO4缓冲液稀释后过ENVI-18 SPE柱，乙腈洗脱，HPLC检测。11种激素的LOD为0.009～0.020mg/kg，平均回收率为51%～107%，RSD为0.77%～6.42%，相关系数为0.9995～0.9999。Xu等用反相C18柱纯化富集了肌肉组织中的10种ASs。甲醇和水进行活化后上样，10%的甲醇溶液淋洗，最后用甲醇洗脱，浓缩后上LC-MSMS分析。方法平均回收率范围为70%～89%，CV为7.1%～19.1%；LOD为0.06～0.22μg/kg，LOQ为0.12～0.54μg/kg。班付国等用乙酸乙酯提取水产品中的群勃龙，提取液氮气吹干，加入20%甲醇溶液溶解，再进行C18柱净化。C18柱用3mL甲醇、3mL水活化，用3mL 40%甲醇溶液淋洗，吹干，用3mL甲醇洗脱，洗脱液氮气吹干，残留物加80%甲醇溶液0.5mL溶解，过膜后供LC-MS测定。不同基质中，群勃龙在2～100ng/mL的浓度范围内呈现良好的线性相关，相关系数在0.994以上，回收率为74.2%～119%，批内CV为1.0%～9.0%，批间CV为0.3%～8.5%。

B.氨基柱

张鸿伟等建立了同时检测肌肉中16种ASs的液相色谱-四极杆/离子阱质谱(LC-Q/Trap-MS)方法。肌肉中的ASs采用乙腈超声辅助提取，正己烷脱脂，二氯甲烷-甲醇(8+2，v/v)定容后经氨基SPE柱净化。将定容后的提取液加载至氨基SPE上，收集流出液，然后用二氯甲烷-甲醇(8+2，v/v)进行洗脱，合并流出液和洗脱液，氮气吹干，LC-Q/Trap-MS检测，内标法定量。结果表明，16种ASs线性关系良好(r≥0.999)，LOQ为0.029～0.36ug/kg，3个添加水平(0.5ug/kg、2.0ug/kg和20μg/kg)下的回收率为89.9%～118%，RSD为6.3%～16.2%。

C.氰基柱

Impens等建立了快速检测肾脂肪中ASs残留的GC-MS/MS方法。乙腈提取液中加入正己烷除脂，氮吹蒸干，加入10mL正已烷溶解，依次加入2.5mL 0.1mol/L NaOH和1.25mL 1.0mol/L mgCl2进行皂化，60℃孵育30min，3000r/min离心5min，将上清液旋转蒸干。加入2.5mL正己烷复溶，然后经氰基柱净化。氰基柱用乙酸乙酯、正已烷平衡，上样，正己烷淋洗，乙酸乙酯-正己烷(90+10，v/v)洗脱，洗脱液氮气吹干，分析物经三甲基硅醚衍生化后，GC-MS/MS检测。方法LOD为2～50ug/kg，CCa为1～6μg/kg，CCβ为2～10μg/kg。

D.硅胶柱

Marchand等采用GC-MS检测肉中的超痕量ASs。醋酸盐缓冲液(提取液)中加入葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶，52℃酶解15h(pH5.2)，再转移至硅胶SPE柱净化。SPE柱已经乙酸乙酯、甲醇、水活化，正己烷淋洗干扰物，正已烷-乙醚(70+30，v/v)洗脱，洗脱液旋转蒸干，衍生后，用GC-MS测定。该方法测得23种ASs的LOD为5～100ng/kg。

E.氧化铝柱

Rejtharova等开发-种用于测定动物脂肪组织中6种ASs(四烯雌酮、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、乙酰氧基和氯地孕酮乙酸酯)残留的检测方法。采用甲醇提取，待提取液旋转蒸干后，加入2mL甲苯-正已烷(5+9，v/v)溶解。采用氧化铝柱净化，上样后，氧化铝柱依次用5mL甲苯-正己烷(5+9，v/v)、10mL甲苯和5mL甲苯-乙醇(99+1，v/v)淋洗，分析物再用甲苯-乙醇(99+1，v/v)洗脱，洗脱液于40℃下旋转蒸干。加入0.5mL甲醇-水溶液(6+4，v/v)超声溶解，0.2um滤膜过滤后LC-MS/MS测定。该方法已按照2002/657/EC进行验证，LOD范围在0.3～1.7ng/g之间，回收率为80%～105%。

F.交联葡聚糖柱

林奕芝等采用GC-MS测定肉中雌二醇、戊酸雌二醇、炔雌醚和苯甲酸雌二醇的残留量。样品用乙腈超声提取，经二氯甲烷反萃取后浓缩至干，残留物经交联葡聚糖LH-20柱净化，共负荷3次，总量约0.4mL，然后洗提。弃去最先的4.5mL洗提液，分取后面5mL，氮气浓缩至干，衍生化反应后，GC-MS在SIM模式下测定。该方法LOD小于等于20ng/g，回收率为84.6%～92.4%，CV小于或等于1.2%。

G.复合用柱

在ASs残留净化中复合用柱应用也比较多。

Schmidt等建立了LC-MS/MS方法测定牛肉中ASs。样品经过Tris碱化处理后进行酶解16h，然后用叔丁基甲醚进行提取，取有机层浓缩至干后用甲醇-水进行复溶，再用正已烷LLP除脂，然后SPE净化。首先过HLB柱，HLB柱用5mL甲醇和5mL水活化，上样后，用5mL水和5mL甲醇-水(40+60，v/v)淋洗，5mL丙酮洗脱，收集洗脱液。再用氨基柱净化，氨基柱经5mL甲醇和5mL丙酮活化，将HLB柱洗脱液上样，收集流出液进行浓缩，复溶于乙腈-水中。该方法的CCa为0.15～0.79μg/kg，CCβ为0.19～1.10μg/kg，平均回收率为96.0%～104.5%。Kaklamanos等建立了牛血清中12种ASs的LC-MS/MS检测方法。血清样品经过蛋白沉淀后，选择HLB柱和氨基柱分别进行净化处理。HLB柱用甲醇-水(40+60，含2%氨水，v/v)和水淋洗，然后用丙酮-甲醇(80+20，v/v)进行洗脱，收集洗脱液。洗脱液直接经氨基柱净化，收集流出液，浓缩至干，复溶于甲醇后上样。方法LOQ为0.02～0.12ng/mL，LOD为0.01～0.07ng/mL，回收率为70.2%～118.2%。Kaklamanos等还建立了肌肉组织中的20种ASs的LC-MS/MS检测方法。样品用碱水解，叔丁基甲醚提取，除脂后，用HLB和氨基柱分别进行净化。HLB柱用甲醇、水活化，分别用2%氨水溶液(含5%甲醇)、2%氨水溶液(含40%甲醇)淋洗，丙酮-甲醇(80+20，v/v)洗脱，收集洗脱液。洗脱液直接过氨基柱，收集流出液，氮气吹干。该方法LOD为0.03ng/g，LOQ为0.05～0.24ng/g，回收率为78.7%～119.4%。

Galarini等利用C18-氨基串联柱纯化了尿液中的诺龙。C18柱用甲醇和水进行柱前活化，45%的甲醇溶液进行洗涤，同时将串接在C18柱下的氨基柱进行活化，以乙酸乙酯洗脱氨基柱中的分析物，氮气吹干后，复溶于乙酸乙酯后再进行衍生化，最后进行GC-MS/MS分析。该方法的LOQ为1.9μg/L，LOD为1.5μg/L，回收率为90%～110%。

Yang等建立了一种检测猪肉、牛肉、虾肉、牛奶和猪肝中50种ASs的UPLC-MS/MS残留方法。样品经酶解，甲醇提取后，加入超纯水稀释，然后采用GCB柱净化，GCB柱依次用6mL二氯甲烷-甲醇(70+30，v/v)、甲醇、水进行活化，上样后，用1mL甲醇淋洗，真空泵抽干，接着用氨基柱净化，氨基柱用4mL二氯甲烷-甲醇(70+30，v/v)进行活化，直接放在GCB柱下，用8mL二氯甲烷-甲醇(70+30，v/v)进行洗脱，将洗脱液氮吹至干，分析物加入1mL甲醇-水(1+1，v/v)复溶后，用UPLC-MS/MS分析。方法LOQ为0.04～2.0ug/kg，平均回收率为76.9%～121.3%，RSD为2.4%～21.2%。