8.2.4.7 分析条件的选择

(1)酶解

群勃龙在样品中往往与蛋白等物质稳定结合，文献多采用β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶水解。但酶解条件各有差异(包括酶的用量、酶解温度和时间、不同缓冲液体系及pH等)。实验发现样品在乙酸钠缓冲体系(pH=5.0)中，用20个单位酶用量，在37℃水域酶解5～16h,分析物可完全水解，回收率较高。

(2)提取净化

群勃龙为酯溶性化合物，实验发现用乙酸乙酯可从酶解液中有效提取出被测物。固相萃取技术是比较有效的净化手段。本方法对硅胶柱、C18柱、混合型柱、免疫亲和柱以及C18-氨基柱串联均作了实验，结果发现了以上萃取柱的净化效果均不佳，仍有内源干扰物影响组分的测定。考虑到动物组织中油脂蛋白等大分子较多，实验用了GPC净化提取液。由图8-21可知，群勃龙标准10.5～15min中可被流动相从GPC色谱柱中林洗出来，所以设定GPC的程序为0～10.5min弃去淋洗液，10.5～15.5min收集淋洗液，然后再淋洗3min凝胶柱。这样就可以除去肝脏肾脏肌肉样品中的部分杂质。但从图8-14中可以看出仍有较多的杂质，所以，需要进一步净化。

图8-14 群勃龙标准，肝脏、肾脏、肌肉空白样品的GPC色谱图(UV：250nm)
(a)a,β-群勃龙混标色谱图：(b)肾脏空白样品色谱图：(c)肝脏空白样品色谱图：(d)肌肉空白样品色谱图

考虑到群勃龙是弱极性化合物，考察了硅胶固相萃取柱的净化条件。淋洗液和洗脱液均用5mL实验了不同丙酮和正己烷比例下的回收率，实验结果见表8-27和表8-28。

表8-27 淋洗液比例对回收率的影响

表8-28 洗脱液比例对回收率的影响

由表8-27实验结果得出，用丙酮-正已烷(10+90，v/v)淋洗液5mL，去杂效果最好，待测物没有被洗脱。由表8-28试验结果可知，当丙酮正己烷的体积比大于3：7时，5mL的洗脱液可将分析物完全解吸。但实验发现丙酮的比例大于3：7时，过多的杂质也被洗脱，所以实验选择丙酮-正己烷(3：7，v/v)做洗脱液。

(3)仪器条件的选择

1)HPLC仪器条件的选择

参考各种文献的报道，先后选择了Cloversil ODS-U 5um 4.6mm×250mm，ZORBAX Eclipse XDB-C184.6mm×150mm 5um，Diamonsil (TM)钻石C18 5um 150mm×4.6mm。其中Diamonsil(TM)钻石C18柱对被测物的分离效果及峰形均满足要求且无干扰峰影响测定结果。在流动相选择上，采用水-乙腈-甲醇(50+20+30，v/v/v)三元体系，有机溶液含量较高可缩短分析时间，但在肝脏样品中有杂质干扰β-群勃龙的测定，最终，选择了上述体系可将干扰峰与分析物色谱峰完全分离，不影响组分的测定。

2)HPLC-MS仪器条件的选择(监测离子的确定)

按照质谱测定的一般要求，先对各化合物进行全扫描，随后对各个化合物确定监测离子，采用选择离子模式以提高检测灵敏度。监测离子的确定是按每种化合物的质谱图和结构特性选取。