8.2.5.7 分析条件的选择

(1)酶解

群勃龙和19-去甲睾酮在样品中往往与蛋白等物质稳定结合，文献多采用β-葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶水解。但酶解条件各有差异(包括酶的用量、酶解温度和时间、不同缓冲液体系及pH等)。实验发现牛尿液样品在pH=5.0左右，用400个单位酶用量，在37℃酶解2h，分析物即可完全水解，回收率较高。

(2)提取净化

固相萃取技术是比较有效的净化手段，本方法对硅胶柱、C18柱、混合型柱、免疫亲和柱和C18-氨基柱串联作了实验，结果发现了C18柱、硅胶柱、混合型柱的净化效果均不佳，即使用C18-氨基柱串联法处理样品，HPLC-MS所得图谱仍有干扰，如图8-16所示。而群勃龙/19-乙烯去甲睾酮免疫亲和柱，不仅净化效果好且操作简便回收率高，故本方法采用免疫亲和柱净化样品。

图8-16 C18-氨基柱串联法处理后所得的总离子流图

(3)仪器条件的选择

1)色谱柱和流动相的选择

用0.1%的乙酸水溶液与乙腈作流动相，在体积比为38：62时，在Inertsil ODS-3 (2.01mm×150mm，5μm)柱上，四种物质可有效分离。0.1%的乙酸水溶液能够使四种分析物离子化。但对于两种规格的ZORBAX SB-C18 (3.0mm×100mm，3.5um和2.1mm×150mm，5μm)均不能使a，β-群勃龙完全分离。

2)监测离子的确定

按照质谱测定的一-般要求，先对各化合物进行全扫描，随后，对各个化合物确定监测离子，采用选择离子模式以提高检测灵敏度。监测离子的确定是按每种化合物的质谱图和结构特性选取的，具体如图8-17。

图8-17 四种分析物的全扫描图及监测离子确定示意图
(a)19-乙烯去甲舉酮；(b)epi-19-乙烯去甲睾酮；(c)β-群勃龙；(d)a-群勃龙