(8)免疫分析法(immunoassay，IA)

免疫分析方法以抗原抗体的特异性反应为基础，以高特异性、高灵敏度著称，可使分析过程简化，适用于复杂基质中痕量组分的分析。主要有化学发光酶免疫法(CLEIA)、放射免疫法(RIA)、放射受体分析法(RRA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、时间分辨荧光免疫(TRFIA)和免疫传感器等。

1)化学发光酶免疫法(chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA)

CLEIA是用参与某一化学发光反应的酶如辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)或碱性磷酸酶(alkaline phosphate，ALP)来标记抗原或抗体，在与待测样品中相应的抗原(抗体)发生反应后，形成固相包被抗体-待测抗原-酶标记抗体复合物，经洗涤后，加入底物(发光剂)，酶催化和分解底物发光，由光量子阅读系统接收，光电倍增管将光信号转变为电信号并加以放大，再把他们传送至计算机数据处理系统，计算出待测物的浓度。

Zhu等建立了牛奶和尿液中ZER的CLEIA检测方法。5mL样品中加入15μL β-葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶于37℃酶解16h，匀浆3min，加入10mL乙腈，3500r/min离心10min，上清液于40℃水浴中氮气吹干，10mL纯水复溶，MAXSPE柱净化，4mL甲酸-甲醇溶液(5+95，v/v)洗脱，40℃水浴中氮气吹干，1mL磷酸缓冲液复溶。在微量板中加入100μL ZER-鸡卵清白蛋白(OVA)碳酸盐缓冲液(1：5000)，4℃包被16h，洗涤3次，37℃封闭1h(150μL每孔)，洗涤3次，加入50uL抗ZER抗体(1：800000)，37℃封闭30min，洗涤5次，加入100μL化学发光底物液，酶标仪检测。方法的LOD为50ng/L，回收率为84.7%～123.6%。Jiang等开发了牛组织中ZER及其代谢物的CLEIA检测方法。模拟分析物半抗原与小牛血清蛋白(BSA)结合，免疫获得单克隆抗体，该抗体对ZAN具有很高的交叉反应性。该方法的LOD为0.05μg/kg；回收率超过75%，CV小于15%。

2)放射免疫分析法(radioimmunoassav，RIA)

RIA是利用同位素标记的与未标记的抗原同抗体发生竞争性抑制反应，反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。自20世纪70年代被首次用于检测动物尿液中DES残留以来，RIA被广泛.地用于动物肌肉肝脏、尿液、牛奶中DES残留检测及DES在动物组织中代谢规律的研究上。

vanPeteghem等用RIA测定肉中DES残留。样品经酶水解，乙醚提取，过SPE柱净化后，RIA测定。LOD达0.07ng/g，回收率为64%～115%。O'eeffe等取小母牛颈部肌肉进行RIA分析检测DES。样品粗提物经C18柱纯化，DES的LOD可达40pg/g。Gaspar等用反相C18柱抽提和纯化尿液，对22份未经添加DES的动物尿液和76份已知不同添加浓度的动物尿液进行RIA分析。未经处理的样品DES测量值平均为0.07ng/mL；添加值1ng/mL时，添加样本所测值与实际值相关系数为0.982。Stitch等认为尿液中存在一种与DES结构相似的酚类化合物，这被作为尿液检测中假阳性出现比较高的-种解释。RIA与其他技术联合，如HPLC-RIA、Celite-RIA可以有效地去除样品中杂质对DES检测的干扰、富集待测DES、提高检测灵敏度。

3)放射受体分析法(radio receptor assay，RRA)

RRA是以受体蛋白作为特异性联结剂，测定待测物(配体)的一种竞争性放射分析法。受体是细胞内的一-种蛋白质，它能与配体特异结合，且有高度亲和力。它与RIA的分析原理基本相似，不同的是，RIA法是通过抗体与分析物结合，而RRA是通过受体与分析物结合。Arts等用RRA法测定小牛尿液中DES，LOD可达0.6ng/mL。他们给小牛注射50mgDES，然后用RRA法测定尿液，发现在用DES处理后第9天仍然可以在尿液中检测出，与同时用ELISA检测的结果近似。

4)酶联免疫分析法(enzyme-link immunosorbent assay，ELISA)

ELISA是采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定，灵敏度高，操作安全，不需要昂贵的仪器，可以满足大批量快速测定的需求。

Goldstein等用ELISA测定动物组织、细胞、亚细胞中DES含量，检测灵敏度是10ng/mL，与同时用RIA测定的结果相近

Sawaya等对绵羊尿液和鸡肉做添加试验，尿液的添加值为0.5～5ng/mL，用乙酸钠缓冲液稀释尿液，再经C18柱纯化，ELISA法测得绵羊尿液中DES的回收率为90%～106%；鸡肉的添加值为0.2～1.5ng/mL，样本经叔丁基甲基醚反复抽提，C18柱纯化，测得鸡肉中DES的回收率为49%～68%。Li等27建立了鸡和虾组织中DES的ELISA检测方法。鸡和虾组织经乙腈-丙酮溶液(4+1，v/v)提取，三氯甲烷脱脂，ELISA检测。该方法的LOD为600pg/mL，回收率大于79.5%，日内、日间CV低于6%。

王鹤佳等建立了牛尿中ZER残留的ELISA检测方法。牛尿样品6000r/min离心10min，上清液过0.45μm滤膜，取0.5mL，加入3mL 50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4.8)；加入8μL β-葡糖醛酸酶/芳基酯酶，37℃孵育3h，C18柱净化，用3mL甲醇和2mL 50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4.8)分别平衡C18柱，加入0.5mL样品，2mL 50mmol/L醋酸钠缓冲液(pH4.8)和3mL 40%甲醇洗涤C18柱，正压吹干，1mL 80%甲醇洗脱，氮气吹干，用0.5mL稀释液溶解残留物，取50μL用于ELISA检测。方法的LOD为0.6ng/mL，50%抑制浓度(IC50)为3.0ng/mL；以10ng/mL、21ng/mL和35ng/mL浓度添加空白牛尿，回收率在70.0%～116.0%之间，CV在6.0%～15.%之间。贺艳等建立了ELISA法检测牛肉中ZER残留，在1g牛肉样品中加入2mL去离子水和8μL葡糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，37℃水浴酶解2h，8mL乙腈振荡10min，3000g以上离心5min，取上清5mL加入2mL三氯甲烷和6mL正已烷，涡动振荡10min，3000g以上离心5min，去除上层正己烷，取中间层吹干后复溶，ELISA分析。方法的LOD为1.0μg/kg，添加回收率在72.4%～98.6%之间。Ana等采用ELISA方法筛查牛尿中的ZON。分析了50份样品，除了4周岁小牛样品外，均为阳性，最大浓度为241.1ng/mL。

5)时间分辨荧光免疫分析法(time-resolvedfluoroimmunoassay，TRFIA)

TRFIA是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，通过时间延迟，去除非特异性荧光干扰，在固定时间检测特异性荧光，解决了自然背景干扰问题，极大地提高了分析灵敏度。Du等利用生物素链亲和素放大系统建立了DES的TRFIA分析方法。铕(Eu)标记的抗生蛋白链菌素衍生物与铕和二亚乙基三胺五乙酸酸酐偶联作为标记抗生蛋白链菌素，与生物素结合的羊抗鼠IgG作为免疫测定中销标记的抗生蛋白链菌素与抗DES抗体之间的电桥，通过测定Eu+水杨酸(SA)在615nm荧光强度定量测定DES。该方法的线性范围广(0.001～1000.0ng/mL)，检测血清中DES的LOD为0.81pg/mL，回收率为97.4%～107.8%，CV为1.32%-4.04%。

6)免疫传感器(immunosensor，IS)

免疫传感器法是将高灵敏的传感技术与特异性免疫反应结合起来，用以监测抗原抗体反应的生物传感器，具备了免疫分析的高选择性又兼有电化学分析的高灵敏性，易于实现残留检测仪器的便携化、微型化和自动化，具有快速、灵敏、选择性高、操作简便等特点。Liu等建立了基于中空二氧化硅-纳米金-多壁碳纳米管(MSN-GNPs-MWCNTs)复合材料和辣根过氧化物酶抗体-普鲁士蓝-多壁碳纳米管(HRP-Ab-GNPs-PB-MWCNTs)检测牛奶中DES的电化学免疫传感器法。MSN-GNPs-MWCNTs复合材料作为固定基质可以增强电极的电活性和稳定性，HRP-Ab-GNPs-PB-MWCNTs作为标记物用来改进电极的催化活性。方法的LOD为0.12ng/mL，回收率为92%～107%。王传现等建立了电化学免疫传感器法检测动物组织和奶粉样品中的DES。将纳米金(AuNP)修饰在电极.上，然后将石墨烯(Gr)-壳聚糖(CS)复合物饰于玻碳电极表面，通过循环伏安法对修饰的电极进行表征。以[Fe(CN)6] 3-/4-为氧化-还原探针，基于DES抗原抗体反应引起[Fe(CN)6]3-/4-探针的电流响应的变化，来实现对DES的检测。DES的质量浓度在0.5～1500.0ng/mL范围，与峰电流呈良好的线性关系，相关系数为0.985，LOD为0.1ng/mL。检测猪肉、牛肉、鸭肉和奶粉中DES的回收率分别为71.2%～117.7%、80.5%～110.1%、80.8%～117.8%和72.3%～117.2%。

Feng等采用纳米多孔PtCo合金作为抗体的载体制备免疫传感器，将ZER抗体偶联到玻碳电极，结果发现无酶的米多孔PtCo合金免疫传感器对抗原抗体反应具有极强的点催化活性，检测牛尿中的ZER的检测限为13pg/mL。Feng等又将纳米蒙脱石转化为钠蒙脱石(Na-Mont)，用于硫堇(TH)、辣根过氧化物酶(HRP)和次级抗ZER抗体(Ab2)的固化。修饰后的微粒(Na-Mont-TH-HRP-Ab2)被用作免疫传感器检测ZER的标记物。采用固定有一级抗体(Ab1)，表面用玻碳电极(GCE)修饰的纳米多孔金膜(NPG)制备免疫传感器。在0.01～12ng/mL浓度范围，ZER的相关系数r为0.9996；LOD为3pg/mL。

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