9.2.1.1 适用范围

牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、已烷雌酚、双烯雌酚残留量的液相色谱-串联质谱测定。方法检出限：牛猪肝肾和肌肉组织中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烷雌酚为0.5μg/kg；己烯雌酚和双烯雌酚为1.0μg/kg。

9.2.1.2 方法原理

试样中玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、己烷雌酚、双烯雌酚残留，用叔丁基甲基醚和乙酸盐缓冲溶液加酶解剂分别提取，硅胶固相萃取柱净化后浓缩，用液相色谱-串联质谱仪测定，保留时间和离子丰度比定性，内标法定量。

9.2.1.3试剂和材料

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正已烷、二氯甲烷、叔丁基甲基醚：色谱纯；乙酸、乙酸钠(CH3COONa：3H2O)：优级纯。

乙酸盐缓冲溶液：0.2mol/L，pH=5.2。称取2.72g乙酸和12.95g乙酸钠溶解于800mL水中，用氢氧化钠溶液调节pH至5.2±0.1，加水定容至1000mL。

氢氧化钠：优级纯；氢氧化钠溶液：3mol/L。称取120g氢氧化钠溶于1000mL去离子水中；

溶解液：正己烷+二氯甲烷(60+40，v/v)。量取60mL正已烷与40mL二氯甲烷混合。

淋洗液：乙酸乙酯+正已烷(6+94，v/v)。量取6mL乙酸乙酯与94mL正己烷混合。

洗脱液：乙酸乙酯-正己烷(60+40，v/v)。量取60mL乙酸乙酯与40mL正己烷混合。

β-葡糖苷酸酶：H-2型，含β-葡糖苷酸酶124400unit/mL，硫酸酯酶3610units/mL。

激素及代谢物标准物质：玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇和β-玉米赤霉醇，各50%)、玉米赤霉酮：纯度≥97%；己烯雌酚，纯度≥99%；己烷雌酚、双烯雌酚：纯度≥98%。

激素及代谢物标准溶液：分别准确称取适量的玉米赤霉醇、玉米赤霉酮、己烯雌酚、双烯雌酚和己烷雌酚标准物质，用甲醇配制成1.0mg/mL标准储备溶液。再根据需要以甲醇配制成不同浓度的混合标准溶液作为标准工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用3个月。
内标标准物质：氘代玉米赤霉醇(包括a-玉米赤霉醇-4氘代和β-玉米赤霉醇-4氘代，各50%)，纯度≥99%；己烯雌酚-8氘代，纯度≥98%。

内标标准溶液：准确称取适量玉米赤霉醇-4氘代和己烯雌酚-8氘代标准物质，用甲醇分别配制成1.0mg/mL内标标准储备溶液。再以甲醇稀释成与5ng/mL玉米赤酶醇和己烯雌酚峰面积或峰高相当浓度的混合内标标准工作溶液，保存于4℃冰箱中，可使用3个月。
硅胶固相萃取柱：500mg，3mL。使用前用6mL正己烷分两次预洗硅胶柱，流速均为4mL/min。

9.2.1.4 仪器和设备

液相色谱-串联质谱联用仪：配有大气压化学电离源；分析天平：感量0.1mg和0.01g；自动固相萃取仪或固相萃取装置；高速均质器：转速大于10000r/min；氮气浓缩仪；涡旋振荡器；离心机：转速大于3000r/min；pH计：测量精度±0.2pH单位；具塞试管：25mL，50mL；微量注射器：25μL，100μL。

9.2.1.5 样品前处理.

(1) 样品制备

取有代表性样品500g，绞碎后搅拌均匀，制成实验室样品。试样分为两份，置于样品盒中，密封，并做上标记。制备好的试样置于-18℃冰柜保存。

(2)试样称取

称取5个阴性样品，每个样品为5g(精确到0.01g)，置于50mL离心管中，分别加入不同量混合标准工作溶液，使玉米赤霉醇、玉米赤霉酮和己烷雌酚的浓度为1.25ng/mL、2.5ng/mL、5.0ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL；己烯雌酚和双烯雌酚的浓度为2.5ng/mL、5.0ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL。再分别加入适量内标标准工作溶液，使内标物浓度均为10ng/mL。

(3)提取

加入20mL叔丁基甲基醚，在10000r/min转速下高速均质1min。3000r/min离心5min，将上清液全部转移至另一50mL具塞试管中备用。离心管中的残渣置于通风橱中挥发30min，加入15mL乙酸盐缓冲液，高速均质1min，3000r/min离心5min，将上清液全部转移至另一25mL具塞试管中，并在氮气浓缩仪上于40℃水浴中吹去残余叔丁基甲基醚后，加入80μL β-葡糖苷酸酶混匀，于52℃烘箱中放置过夜。在此缓冲溶液中加入氢氧化钠溶液将溶液pH值调至7，加入10mL叔丁基甲基醚，充分混合，3000r/min离心2min。移取叔丁基甲基醚层与前述的叔丁基甲基醚提取液混合，在氮气浓缩仪上于40℃水浴中吹干。加入1mL溶解液，涡旋30s溶解，待净化。

(4)净化

把样液转入硅胶固相萃取柱，流速为2mL/min，在样品试管中加入3mL淋洗液，混合后过柱，流速为2mL/min，用3mL淋洗液以3mL/min的速度淋洗，加入2mL空气以4mL/min的速度吹过硅胶柱。用6mL洗脱液洗脱，流速为2mL/min，加入2mL空气以6mL/min的速度吹过硅胶柱，收集洗脱液。将洗脱液在氮气浓缩仪上于40℃水浴中吹干，加入1mL流动相，涡旋30s溶解。溶液经滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱测定。

(5)试样溶液的制备.

称取待测样品5g(精确到0.01g)于50mL离心管中，加入内标标准工作溶液，使内标物含量均为2.0μg/kg，按上述步骤操作。

(6)空白基质溶液的制备

称取阴性样品5g(精确到0.01g)于50mL棕色离心管中，按上述步骤操作。