10.1.4 残留分析技术

10.1.4.1 前处理方法

(1)水解方法

由于GCs会与内源性的葡萄糖醛酸结合，以结合态形式存在于生物基质中，在分析GCs残留时，常需要使用酶水解样品，释放出游离态的GCs。使用最多的是β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶等。

Yang等叫利用酶水解提取肌肉(猪肉、牛肉和虾)、牛奶和肝脏中的50种同化激素(包括曲安西龙、泼尼松、可的松、氢化可的松、泼尼松龙、氟米松、醋酸氟氢可的松、甲泼尼龙、倍氯米松、地塞米松、曲安奈德、氟轻松、布地奈德、丙酸氯倍他索等GCs)。在5g样品中加入10mL乙酸盐缓冲液(0.2mol/L，pH5.2)，再加入100μL葡糖醛酸糖苷酶/芳基硫酸酯酶，37℃过夜，甲醇提取，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测。方法的定量限(LOQ)为0.04～2.0μg/kg，平均回收率为76.9%～121.3%，变异系数(CV)为2.4%～21.2%。李存等口在猪肝脏样品中加入50μL的β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶，在10mL乙酸铵溶液中，40C下酶解2h。在0.75μg/kg、1.5μg/kg和2.0μg/kg添加水平下，样品中地塞米松和倍他米松的回收率在97.3%～111%之间。韩立等利用酶水解提取动物尿液样品中泼尼松、泼尼松龙、甲基泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、倍氯米松、醋酸氟氢可的松、醋酸可的松和氢化可的松等9种GCs，准确吸取尿液试样5.0mL，置于50mL离心管内，用乙酸调pH5.2，加入0.02mol/L乙酸铵缓冲液5.0mL，再加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶50μL，涡旋混匀，于37℃±1℃避光振荡16h。乙酸乙酯提取，HLB柱串联氨基柱净化，LC-MS/MS分析。方法的检出限(LOD)为0.5ng/mL，LOQ为1.0ng/mL，回收率为55.0%～106.2%，批内、批间CV均低于15.4%。

VanDenHauwe等使用蜗牛液(Helixpomatiajuice)水解牛肝脏样品，建立了可以检测11种GCs(倍他米松、地塞米松、氟米松、泼尼松、泼尼松龙、甲泼尼龙、氟氢可的松、曲安西龙、曲安奈德、倍氯米松和可的松)的LC-MS/MS方法，并对酶水解的温度、pH和水解时间进行了优化。结果显示，在pH5.2、40℃、时间不超过4h时，可以取得满意的水解效果。

(2) 提取方法

GCs残留分析主要采用液液萃取(LLE)的提取方法。近年来，一些新的提取技术，如加压溶剂萃取(PLE)、超声辅助萃取(UAE)、固相微萃取(SPME)等也开始应用到GCs残留的提取中。

1) 液液萃取(liquidliquidextraction，LLE)

LLE是最为常用的GCs提取方法，提取溶剂主要包括甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚、乙醚、乙酸乙酯以及缓冲溶液等。

牛晋阳等建立了猪肉中GCs多残留分析方法。样品经甲醇提取，免疫亲和柱净化后，采用LC-MS/MS进行检测分析。GCs的线性范围均为0.5～100μg/kg，低、中、高3种质量浓度加标回收率均为78%～101%，LOD为0.2～2μg/kg。崔晓亮等开发了牛奶中12种GCs残留的分析方法。试样中加入pH5.20的醋酸盐缓冲溶液和甲醇，超声提取，去除部分蛋白质，然后用正已烷脱脂，依次经HLB柱、硅胶柱和氨基柱等固相萃取柱浓缩和净化后，LC-MS/MS测定。该法的LOD为0.02～0.38μg/kg，LOQ为0.07～1.27μg/kg；添加水平为2ug/kg和0.4ug/kg时，加标回收率为69.3%～94.3%，相对标准偏差(RSD)为3.5%～16.7%。VandenHauwe等报道了检测牛肾脏、肌肉和毛发中GCs的方法。样品经酶水解后，用甲醇提取，固相萃取柱净化后用LC-MS/MS测定。方法性能指标满足残留分析要求。徐锦忠等建立了鸡肉和鸡蛋中泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、氟氢可的松、甲基泼尼松、倍氯米松及氢化可的松多残留检测方法。样品经乙腈超声提取，正已烷脱脂净化后，进行LC-MS/MS定性及定量分析。该方法的LOQ为0.5μg/kg；在0.5μg/kg、1.0μg/kg和5.0μg/kg浓度添加水平，平均回收率为73.4%～108.9%，RSD为3.4%～13.4%。Zhang等建立了检测血浆中地塞米松和地塞米松磷酸钠的分析方法。采用乙腈-甲醇混合溶液提取并沉淀蛋白，LC-MS/MS测定。该方法在0.5～500ug/L呈线性(r大于0.99)，日内和日间的CV小于10%，LOQ为0.5ug/L。

李飞等建立了速冻调制肉制品中7种GCs(泼尼松、泼尼松龙、地塞米松、倍他米松、氟氢可的松乙酸盐、倍氯米松、氢化可的松)的残留检测方法。样品经乙酸乙酯提取后，过硅胶固相萃取柱净化，最后用乙腈定容，LC-MS/MS测定。方法的LOD为0.2～1.0μg/kg，LOQ为0.5～2.0μg/kg；添加回收率范围为85.0%～96.4%，RSD为2.3%～6.1%。Shearan等开发了牛肉、肾脏、肝脏和脂肪组织中地塞米松的检测方法。牛肉、肾脏、肝脏用乙酸乙酯提取，脂肪用乙醚提取，经净化后，用高效液相色谱(HPLC)检测。该方法的LOD可达到0.01mg/kg。Mazzarino等通过调节pH后，采用甲基叔丁基醚提取尿液中的16种合成GCs，经LC-MS/MS测定，方法LOD在1～50ng/mL之间。Earla等采用甲基叔丁基醚提取兔眼组织中的地塞米松和泼尼松龙，净化后用LC-MS/MS测定。地塞米松和泼尼松龙的LOQ为2.7ng/mL和11.0ng/mL，日内和日间精密度为13.3%和11.1%，准确度为19.3%和12.5%。Zou等利用乙醚-环己烷混合溶液提取血浆中的倍他米松，在0.5mL血浆中加入3mL乙醚_环己烷(4+1，v/v)，涡动混合3min，4000r/min离心10min，有机层氮气吹干，150μL流动相复溶，LC-MSMS分析。该方法的回收率为92.5%～106.5%，LOQ为0.1ng/mL。Salem等采用乙醚-环已烷提取血液中的倍他米松及其乙酸和磷酸酯，固相萃取净化后，LC-MS/MS测定。倍他米松的LOD为0.50ng/mL，其乙酸酯的LOD为1.00ng/mL，在2.0～200.0ng/mL范围呈良好线性。邹晓春等0用乙酸钠-乙酸缓冲溶液匀浆，超声振荡，对肉中5种GCs进行提取，再用HLB固相萃取小柱净化，LC-MS/MS测定。在不同浓度水平下各GCs的平均加标回收率均在86.2%～102.8%之间，相对标准偏差(RSD)均小于10.4%；LOD为0.026～0.093μg/kg，LOQ在0.087～0.31μg/kg之间。

2)加压溶剂萃取(pressurized liquid extraction，PLE)

PLE是指在较高的温度(50～200℃)和压力(1000～3000psi或10.3～20.6MPa)下，用溶剂萃取固体或半固体样品的新颖的样品前处理方法。与传统提取方式相比，PLE速度快、溶剂用量少、萃取效率高、待测组分回收率好，可实现全自动安全操作。Chen等建立了牛、猪、羊可食组织中8种GCs(泼尼松、泼尼松龙、氢化可的松、甲基强的松龙、地塞米松、倍他米松、丙酸倍氯米松和氟氢可的松)的测定方法。以正己烷-乙酸乙酯(50+50，v/v)为提取溶剂，在1500psi和50℃下进行加压溶剂萃取，再进行LC-MS/MS分析。在0.5～6μg/kg添加浓度范围内，方法回收率在70.1%～103.1%之间，LOQ在0.5～2μg/kg之间。

3)超声辅助萃取(ultrasound-assisted extraction，UAE)

UAE是利用超声波辐射压强产生的强烈机械振动、扰动效应、乳化、扩散、击碎和搅拌等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的进行。优点是萃取速度快，价格低廉、效率高。崔晓亮等利用UAE提取牛奶中的12种GCs。称取5.0g均匀的牛奶试样，置于50mL离心管中，加入10mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(0.2mol/L，pH5.20)和35mL甲醇，超声振荡5min，于0℃下10000r/min离心10min，正己烷脱脂，固相萃取柱净化，LC-MS/MS分析。该方法的LOD为0.02～0.38μg/kg，LOQ为0.07～1.27ug/kg，回收率为69.3%～94.3%，RSD为3.5%～16.7%。Caretti等采用三氟乙酸溶液在UAE条件下提取牛奶中的13种GCs，经富集和净化后，用LC-MS/MS测定，地塞米松-D4为内标定量。方法回收率超过70%，日内精密度小于12%。

4)固相微萃取(solid phase microextraction，SPME)

SPME是在固相萃取技术.上发展起来的一种微萃取分离技术，是一种集采样、萃取、浓缩和进样于一体的无溶剂样品微萃取新技术。与固相萃取技术相比，SPME操作更简单，携带更方便，操作费用也更加低廉；另外，克服了固相萃取回收率低、吸附剂孔道易堵塞的缺点。Ebrahimzadeh等报道了采用基于载体介导转运的三相中空纤维微萃取技术提取牛奶、血清中地塞米松磷酸钠的方法。以含有5% (w/v) Aliquate-336的正辛醇作为载体，将地塞米松磷酸钠从7.5mL pH3酸性溶液(源相)萃取到有机相中，并含浸在中空纤维的孔中，最后再用24uL pH9.5位于中空纤维内腔里面(接收相)的碱性溶液萃取。提取基于从源相到接收相抗衡离子的梯度而发生。作者对影响提取效率的参数进行优化。在优化条件下，预浓缩因子为276，LOD为0.2μg/L，线性范围为1～1000μg/L，RSD小于7.2%。

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