12.2.2.7分析条件的选择

(1)提取净化条件的选择

1)净化柱的选择

在该项研究中，使用OasisHLB固相萃取柱、C18固相萃取柱、阴离子交换柱(醋酸型)和阳离子交换柱(苯磺酸型)进行了提取和净化实验。实验发现，使用阳离子交换柱和C18固相萃取柱都存在着不尽如人意的地方，阳离子交换柱回收率低(只有50%～60%)，且净化效果也不理想，而C18固相萃取柱则存在着不同批次之间回收率的显著差异。而使用OasisHLB固相萃取柱和阴离子交换柱净化样品消除了不同批次交换柱之间回收率的差异，保证了回收率均在70%以上，净化效果也达到了令人满意的效果，因此本方法选择OasisHLB固相萃取柱和阴离子交换柱作为净化柱。

2)提取液pH对回收率的影响

分别用6个不同pH的0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液作为提取液，按规定方法进行回收率实验，回收率数据见表12-13。

表12-13 0.1mol/L Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液pH对回收率的影响

从表12-13中数据可以看出:四环素、金霉素在pH=3～4.5区间内，回收率是基本稳定的，当pH>5.0时，回收率随pH的增大而降低；土霉素、强力霉素从pH=3.0起，随pH的增大而增大，当pH=4时，达到最大值，而后又随pH值的增大，其回收率逐步降低，因此，本方法选择pH=4.0的0.1mol/L Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液做为测定蜂蜜中土霉素、四环素、金霉素和强力霉素的提取液。

3) OasisHLB柱洗脱剂的选择

使用OasisHLB柱作为净化柱，用乙腈、甲醇、甲醇-乙酸乙酯混合液、乙酸乙酯作为洗脱剂进行了比较。实验发现，用乙腈、甲醇作洗脱剂，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素在5mL之内均能从OasisHLB柱完全洗脱下来，但绝大多数样品在土霉素和四环素出峰的时间区域内有干扰峰，影响其定量，若遇到颜色深或成分复杂的蜜样，在土霉素和四环素出峰之前仪器的响应值根本回不到基线，无法对其测定。而使用不同配比的甲醇乙酸乙酯溶液，虽然干扰远比使用甲醇、乙腈要好得多，但在测定较低添加水平(如0.01～0.02mg/kg)的土霉素、四环素时，也同样存在着干扰峰，仍对测定产生一定的影响。而使用乙酸乙酯作洗脱剂，虽然用量稍多些，但无论是测定什么样品，均能获得令人满意的效果和回收率，因此，本方法选用乙酸乙酯作为OasisHLB柱的洗脱剂。

4) 洗脱剂用量的选择

OasisHLB固相萃取柱和阴离子交换柱洗脱剂用量的选择，实验数据见表12-14和表12-15。表12-14和表12-15中数据表明，OasisHLB固相萃取柱用15mL乙酸乙酯洗脱和阴离子交换柱用4mL流动相洗脱其四种四环素的回收率均在99%以上。

表12-14 OasisHLB固相萃取柱洗脱剂用量对回收率(%)的影响

表12-15 阴离子交换柱洗脱剂用量对回收率(%)的影响

(2) 色谱条件的确定

1) 检测波长的选择

使用紫外分光光度计对土霉素、四环素、金霉素、强力霉素进行扫描，发现这四种四环素族抗生素的最大吸收波长均在340～380nm之间，并且吸收谱带较宽，为确定这四种四环素族抗生素最佳测定波长，又分别用高效液相色谱仪对这四种四环素族抗生素分别在不同波长下进行测定，测定结果见表12-16。

表12-16 在不同测定波长，四种四环素族抗生素(每种20ng)响应值(峰高)

从表12-16中可以看出，土霉素、四环素和强力霉素最大吸收波长均在350～355nm之间，而金霉素的最大吸收波长却在365nm，因土霉素、四环素的灵敏度明显高于金霉素和强力霉素，所以，重点考虑金霉素和强力霉素的灵敏度，在强力霉素最大吸收波长350nm时，金霉素的峰高(795)仍比强力霉素的峰高(756)还高，因此只有选择350nm作为检测波长，才能使这两种四环素族抗生素都能满足欧盟及德国进口蜂蜜合同所规定的限量要求，所以选择了350nm作为本方法的最佳检测波长。若只检测土霉素、金霉素和四环素三种抗生素则检测波长选择365nm。

2) 液相色谱分析柱和流动相的选择

分别使用Nova-Pak C18 150mm×3.9mm，Symmetryshield RP18 150mm×3.9mm，μBondapakC18 300mm×4.0mm三种液相色谱柱对土霉素、四环素、金霉素、强力霉素进行对比试验，实验发现Nova-PakC18柱分离度尚可，但峰较宽，峰形也有拖尾现象，且灵敏度低；Symmetryshield RP18柱虽然峰形好，但出峰时间太早，(土霉素、四环素的出峰时间均在2.5min之前)，并且土霉素和四环素不能完全分离，复杂样品中的杂质对土霉素有干扰。当减少有机相配比，土霉素和四环素出峰时间后移到3min以后，两个峰能完全分离，但金霉素和强力霉素的灵敏度明显下降，不能满足欧盟及德国进口蜂蜜合同规定的限量要求。只有μBondapakC18色谱柱即能做到各被测组分峰的完全分离又能满足限量要求，所以本方法选择μBondapakC18柱作为四环素族抗生素的分析柱。

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