12.2.3.6 测定

(1) 液相色谱条件

色谱柱：MightsilRP-18g P，3um，150mm×4.6mm或相当者；流动相：乙腈+甲醇+0.01mol/L草酸溶液(2+1+7，v/v/v)；流速：0.5mL/min；柱温：25℃；检测波长：350nm；进样量：60μL。

(2) 液相色谱测定

将混合标准工作溶液分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间分别为4.82min、5.42min、10.32min、15.45min。土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准液相色谱图见图12-5。

图12-5 土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图

12.2.3.7 分析条件选择

(1)提取净化条件的优化

本方法对比了用OasisHLB单一固相萃取柱净化和OasisHLB固相萃取柱、羧酸型阳离子交换柱双柱净化的净化效果。实验发现，只用OasisHLB固相萃取柱净化，在4.3min、4.9min、5.5min和8.2min均有比较大的干扰峰存在，当土霉素、四环素、金霉素和强力霉素含量小于0.010mg/kg，对检测结果均有影响，如图12-6所示；而采用OasisHLB和羧酸型阳离子交换柱双柱净化，从4min到18min之间均无干扰峰，见图12-7。因此，在AOAC 995.09标准方法的基础上，增加了羧酸型阳离子交换柱净化步骤，改进了净化效果，减少了基质干扰，提高了方法的准确度。因此，增加羧酸型阳离子交换柱净化步骤是十分必要的。

图12-6 OasisiHLB固相萃取柱净化后样品空白图

图12-7 OasisHLB和羧酸型双固相萃取柱净化后样品空白图

(2)色谱柱的选择

分别使用μBondapak C18 10 um( 300 mm× 4 mm)， Inertsil C8-3 5 μum( 150 mm×2.1 mm)和Mightsil RP-18gP， 3 um (150 mm×4.6 mm) 3种液相色谱柱对土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的分离度和灵敏度进行了对比试验。实验发现，这3种液相色谱柱对4种四环素族抗生素的分离效果均很好，但检测灵敏度存在很大差异，uBondapak C18柱和Inertsil C8-3 5 um柱土霉素和四环素检出限为0.005 mg/kg、金霉素和强力霉素检出限为0.010 mg/kg，而Mightsil RP-18 gP柱土霉素和四环素检出限为0.002 mg/kg，金霉素和强力霉素检出限为0.005 mg/kg，灵敏度比前两个分析柱高1倍，因此，本方法采用mightsil RP-18 gP柱作为四环素族抗生素的分析柱。