12.2.4.1 适用 范围

适用于河豚鱼、鳗鱼中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的液相色谱紫外法测定。方法检出限均为0.010 mg/kg。

12.2.4.2方 法原理

用0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine (pH=4.0±0.05) 缓冲溶液提取河豚鱼、鳗鱼中四环素族抗生素残留，提取液经离心后，上清液用 Oasis HLB固相萃取柱和羧酸型阳离子交换柱净化，液相色谱-紫外检测器测定，外标法定量。

12.2.4.3 试剂和材料

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、正已烷：色谱纯；柠檬酸(C6H8O7·H2O)、磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H2O)、 草酸：分析纯；甲酸：优级纯。

0.1 mol/L柠檬酸溶液：称取21.01 g柠檬酸，用水溶解，定容至1000 mL； 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液：称取28.41 g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000 mL； Mellvaine缓冲溶液：将1000 mL 0.1 mol/L柠檬酸溶液与625 mL 0.2 mol/L磷酸氢二钠溶液混合，用NaOH或HCI调pH=4.0+0.05； 0.1 mol/L Na2EDTA-Mllvaine缓冲溶液：称取60.5g乙二胺四乙酸二钠放入1625 mL mcllvaine缓冲溶液中，使其溶解，摇匀； 0.01 mol/L草酸溶液：称取1.26 g草酸用水溶解，定容至1000 mL； 2%甲酸溶液：量取2mL甲酸，用水稀释至1000 mL；甲醇溶液： (1+19，v/v)。 量取5 mL甲醇和95 mL水混合；洗脱液：乙腈-甲醇-0.01 mol/L草酸溶液(2+1+7， v/v/v)。

土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准物质：纯度≥95%。

0.1 mg/mL标准储备溶液：准确称取适量的土霉素、四环素 、金霉素、强力霉素标准物质，分别用甲醇配成0.1 mg/mL的标准储备液。储备液于-18℃贮存。

6.0 μg/mL中间浓度混合标准溶液：分别吸取0.6 mL标准储备溶液移至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释成6.0 μg/mL的标准混合溶液。该溶液于-18℃贮存。

混合标准工作溶液：用洗脱液将中间浓度混合标准溶液稀释成0.005μg/mL、0.010μg/mL、0.050 ug/mL、0.100 ug/mL、0.200 ug/mL不同浓度的混合标准工作溶液，混合标准工作溶液需当天配制。

OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处理，保持柱体湿润。
阳离子交换柱：羧酸型，500 mg，3 mL。使用前用5 mL乙酸乙酯预处理，保持柱体湿润。

12.2.4.4 仪器 与设备

液相色谱仪：配有紫外检测器；分析天平：感量0.1 mg， 0.01 g；液体混匀器；固相萃取装置；贮液器： 50 mL；高速冷冻离心机：最大转速13000 r/min；刻度样品管： 5mL，精度为0.1 mL；真空泵：最大真空度80 kPa； 振荡器；具塞聚丙烯离心管； pH计：测量精度+0.02。

12.2.4.5 样品前处理

(1)试样制备

从全部样品中取出有代表性样品约1 kg，充分搅碎，混匀，均分成两份，分别装入洁净容器内。

密封作为试样，标明标记。在抽样和制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。将试样于-18℃冷冻保存。

(2)提取

称取6g试样，精确到0.01 g，置于50 mL具塞聚丙烯离心管中，加入20 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，于液体混匀器上快速混合1 min，再用振荡器振荡10 min，10000 r/min离心10 min，上层提取液倒入另一具塞离心管中，残渣中再加入15 mL Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液，重复提取一次，合并提取液。鳗鱼样品的提取液中加入20 mL正己烷，振荡5 min，以4000 r/min离心5 min，弃去正己烷相，水相部分待净化。

(3)净化

将提取液倒入下接Oasis HLB固相萃取柱的贮液器中，提取液以小于3 mL/min的流速通过固相萃取柱，待提取液完全流出后，用5 mL甲醇溶液洗柱，弃去全部流出液。固相萃取柱减压抽干40 min，然后用15mL乙酸乙酯洗脱，下 接预先处理好的阳离子交换柱，调节流速小于3 mL/min，待乙酸乙酯全部流出后，取下Oasis HLB柱，用5 mL甲醇淋洗阳离子交换柱，弃去全部流出液。阳离子交换柱减压抽干5 min，再用4 mL洗脱液洗脱，收集洗脱液于5 mL样品管中，定容至4mL，过0.2 um滤膜后，供液相色谱紫外检测器测定。