12.2.4.6 测定

(1)液相色谱条件

色谱柱： BEHC18， 1.7 μm，50 mm×2.1 mm (内径)或相当者：流速： 0.4 mL/min；柱温： 30℃；检测波长： 350 nm；进样量： 10μL； 流动相： A：乙腈，B： 2%甲酸溶液，梯度洗脱条件见表12-23。

表12-23 梯度洗脱条件

(2) 液相色谱测定

将混合标准工作溶液分别进样，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准工作曲线，用标准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的线性范围内。在上述色谱条件下，土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间1.25 min，1.35 min，1.67 min， 1.77 min。土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准液相色谱图见图12-8。

图12-8 土霉素、 四环素、金霉素、强力霉素标准物质液相色谱图

12.2.4.7 结果 与讨论

(1)提取净化条件的优化

在本方法研究中，对比了用Oasis HLB单一固相萃取柱净化和Oasis HLB固相萃取柱、羧酸型阳离子交换柱双柱净化的净化效果。实验发现，只用Oasis HLB固相萃取柱净化，在1.25 min、1.64 min均有比较大的干扰峰存在，当土霉素、四环素、金霉素和强力霉素含量小于0.010 mg/kg，对检测结果均有影响，如图12-9所示；而采用Oasis HLB和羧酸型阳离子交换柱双柱净化，从1 min到2 min之间均无干扰峰，见图12-10。因此，本方法在国际AOAC标准AOAC 995.09的基础上，增加了羧酸型阳离子交换柱净化步骤，改进了净化效果，减少了基质干扰，提高了方法的准确度。因此，增加羧酸型阳离子交换柱净化步骤是十分必要的。

图12-9 Oasis HLB固相萃取柱净化后样品空白图

图12-10 Oasis HLB和羧酸型双固相萃取柱净化后样品空白图

(2) 流动相配比的选择

分别使用恒配比0.01 mol/L草酸+乙腈+甲醇(7+2+1， v/v/v) 和梯度洗脱(2%甲酸+乙腈)对土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的分离度和灵敏度进行了对比试验。实验发现，这两种流动相对4种四环素族抗生素的分离效果均很好，但检测灵敏度和保留时间存在很大差异，当使用恒配比0.01 mol/L草酸+乙腈+甲醇(7+2+1，v/v/v)作为流动相时，土霉素和四环素检出限为0.01 mg/kg、金霉素和强力霉素检出限为0.020 mg/kg，且检测时间长。而使用(2%甲酸+乙腈)作为流动相梯度洗脱时土霉素、四环素、强力霉素检出限为0.005 mg/kg，金霉素检出限为0.01 mg/kg，灵敏度比恒配比洗脱要高1倍，且检测时间也同时缩短。因此，本方法采用(2%甲酸+乙腈)梯度洗脱作为四环素族抗生素的流动相。

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