12.2.1.7 分析条件的选择

(1) 提取净化条件的优化

1) 净化样品固相萃取柱的选择

在本方法的研究中，用蜂蜜样品实验了OasisHLB固相萃取柱、C18固相萃取柱、阴离子交换柱(醋酸型)和阳离子交换柱(苯磺酸型)对四种抗生素的提取效率和净化效果。实验发现，阳离子交换柱回收率低(只有50%～60%)，且净化效果也不理想，而C18固相萃取柱则存在着不同批次之间回收率的显著差异。而使用OasisHLB固相萃取柱和阴离子交换柱净化样品回收率均在70%以上，净化效果也令人满意。因此本方法选择OasisHLB固相萃取柱和阴离子交换柱双柱提取和净化样品。

2) 提取液pH对回收率的影响

本方法用0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取蜂蜜样品中四种抗生素残留。实验发现，提取液的pH不同，对回收率有较大影响。用6个不同pH的提取液，按规定方法进行回收率实验，回收率数据见表12-5。

表12-5 0.1mol/L Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液pH对回收率的影响

从表12-5可以看出：四环素、金霉素在pH=3～4.5区间内，回收率是基本稳定的，当pH>5.0时，回收率随pH的增大而降低；土霉素、强力霉素从pH=3.0起，随pH的增大而增大，当pH=4时，达到最大值，而后又随pH的增大，其回收率逐步降低。因此，本方法选择pH=4.0的0.1mol/L Na2EDTA-Mellvaine缓冲溶液作为蜂蜜中四种抗生素的提取液。

3) OasisHLB固相萃取柱洗脱剂的选择

本方法实验了乙腈、甲醇、甲醇-乙酸乙酯混合液、乙酸乙酯作为OasisHLB固相萃取柱的洗脱剂，比较了不同洗脱剂的净化效果。实验发现，用乙腈、甲醇作洗脱剂，用量在5mL以内，四种抗生素均能从OasisHLB柱上完全洗脱下来。但绝大多数样品在土霉素和四环素出峰区域内有干扰峰，影响其定量，若遇到颜色深或成分复杂的蜜样，对土霉素和四环素的影响更严重。使用不同配比的甲醇乙酸乙酯溶液，净化效果比甲醇、乙腈好，仍对土霉素、四环素的测定有干扰。使用乙酸乙酯作洗脱剂，虽然用量稍多些，但对不同蜂蜜样品，均能获得令人满意的净化效果和较高回收率。因此，本方法选用乙酸乙酯作为OasisHLB柱的洗脱剂。

4) OasisHLB固相萃取柱和阴离子交换柱洗脱剂用量的选择，实验数据见表12-6和表12-7。

表12-6 OasisHLB固相萃取柱洗脱剂用量对回收率(%)的影响

表12-7 阴离子交换柱洗脱剂用量对回收率(%)的影响

表12-6和表12-7中数据表明，OasisHLB固相萃取柱用15mL乙酸乙酯洗脱和阴离子交换柱用4mL流动相洗脱其四种四环素的回收率均在99%以上。

(2) 液相色谱分析柱和流动相的选择

在GB/T18932.4-2002国家标准研究的基础上，对uBondapak C18 300mm×4.0mm色谱柱和Inertsil C8 150mm×2.1mm色谱柱进行了比较，实验发现，这两种色谱柱分离度和灵敏度均能满足要求，但uBondapak C18柱流速在1.5mL/min，进质谱仪之前必须分流，而分流时对四种四环素结果的测定产生一定误差，而使用Inertsil C8柱，不需分流，定量准确度优于uBondapakC18柱，并且又对所使用的流动相进行了比较，比较结果见表12-8。

表12-8 两种色谱柱LC-MS-MS测定的比较

通过以上对两种色谱柱的比较，本方法选用InertsilC8-3为四环素族抗生素的分析柱。

(3)质谱条件的确定

采用注射泵直接进样方式，以5uL/min分别将土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准溶液注入离子源，用正离子检测方式对四种四环素族抗生素进行一-级质谱分析(Q1扫描)，得到分子离子峰分别为461，445，479和445，再对准分子离子进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子信息。土霉素、四环素、金霉素、强力霉素二级质谱图。然后对去簇电压(DP)，碰撞气能量(CE)，电喷雾电压、雾化气和气帘气压力进行优化，使分子离子与特征碎片离子对强度达到最佳。然后将质谱仪与液相色谱联机，再对离子源温度，辅助气流速进行优化，使样液中四种四环素族抗生素离子化效率达到最佳。

百检网就是一家权威的食品检测机构，提供各种检测需求服务，有任何疑问欢迎电联或者在线咨询客服。