14.2.2.7 分析条件的选择

(1)样品前处理条件研究

1)提取溶液的选择

牛奶样品含有大量的蛋白质，它们能结合药物，因此对于某些药物的测定，必须先将与蛋白结合的药物游离之后再作进一步处理。因为样品含有大量的蛋白质，蛋白质在测定过程中会形成泡沫、浑浊或出现沉淀而干扰测定。蛋白质还会污染仪器或恶化测定条件，如直接进样用液相色谱分析含蛋白质的体液样品时，蛋白质会沉积在色谱柱上，这不仅影响柱效，而且大大缩短色谱柱的使用寿命。

通常除蛋白的方法是在含蛋白样品中加入适当的沉淀剂或变性剂，使蛋白质脱水而沉淀(如有机溶剂、中性盐)，有的是由于蛋白质形成不溶性盐而析出(如一些酸类：三氯醋酸、高氯酸、磷酸、苦味酸)，离心后取上清液用于分析。实验比较了不同的蛋白变性剂：甲醇、乙腈、钨酸钠、亚铁氰化钾和硫酸铵对样品提取的影响，结果发现采用甲醇、乙腈、亚铁氰化钾去除牛奶中蛋白，去蛋白效果好，加入蛋白沉淀剂后，容易得到澄清的上清液；而加入钨酸钠或硫酸铵，去蛋白效果差,难以得到澄清溶液。虽然亚铁氰化钾可以有效除去蛋白，实验发现亚采用亚铁氰化钾提取液，样品的提取效果差,这可能是目标化合物容易与亚铁氰化钾发生(络合)反应，导致化合物的损失。采用甲醇沉淀蛋白，甲醇与蛋白形成絮状沉淀；而采用乙腈沉淀蛋白，乙腈与蛋白形成致密沉淀，易离心除去，沉淀效率较甲醇高。故实验选择乙腈作为提取溶剂，不仅能有效提取目标化合物，还能够同时有效去除样品中的蛋白。

2)样品保护剂的选择

由于牛奶中含有丰富的营养元素，如钙、镁等，这些金属的存在容易与目标化合物形成络合物，从而影响样品的测定，故在样品提取中需要加入保护剂以避免金属元素对这些化合物的干扰。实验发现，在加入乙腈提取液前，预先在牛奶样品中加入1.0mol/L的TRIS缓冲溶液，能够使其中的金属形成氢氧化物沉淀，有效保护安乃近各代谢物在溶液中的存在形态，而避免金属或其他物质的干扰。

3)样品净化条件的选择

牛奶和奶粉中含有一定的脂肪，因此在样品分析前需要进行净化以除去脂肪。由于安乃近代谢物极性强，在固相萃取柱上保留很弱，经过固相萃取柱净化损失较大，因此实验选用正己烷进行脱脂，通过在乙腈提取液中加入乙腈饱和的正己烷进行液液分配，提取液中的脂肪得到有效去除。

(2)安乃近代谢残留物的测定

1)色谱柱的选择

比较了Acquity BEH C18，1.7um，50mm×2.1mm；Acquity BEH C8，1.7um，50mm×2.1mm；Inertsil ODS-3，3.5um，150mm×2.1mm， ZORBAX SB-C18，3.5 um，150mm×2.1mm，四种液相分析柱对八种硫代氨基甲酸酯农药的分离效果，结果发现，采用Acquity BEH C18分析柱，所需的分析时间短(5 min内)，并且灵敏度和分离度都比较理想。因此，选择该柱为分析柱。

2)流动相的选择

为了优化流动相，对比了甲醇+5mmol/L乙酸铵水溶液(pH 3.0)、乙腈+5 mmol/L乙酸铵水溶液(pH3.0)、 甲醇+0.1%甲酸水溶液、乙腈+0.1%甲酸水溶液、甲醇+0.1%乙酸水溶液、乙腈+0.1%乙酸水溶液做流动相的色谱效果，实验表明，0.5 mmol/L乙酸铵水溶液(pH 3.0)水溶液作为流动相并采用梯度洗脱时，安乃近各代谢物的峰形、分离度和灵敏度均较好，故实验选择pH为3.0的5 mmol/L的醋酸铵缓冲体系作为水相流动相；相对于乙腈来说，采用甲醇作为有机相，安乃近各代谢物的峰形和分离度较好，故实验选择甲醇作为有机相。

3)质谱条件的选择

质谱条件的优化：首先采用2.0mg/L的FAA、AAA、AA、MAA和IPA标准溶液在正离子模式下进行母离子全扫描，确定FAA、AA、MAA、DAA和IPA的分子离子分别为m/z232，246、204、218和246，然后分别以这些离子作为母离子，对其子离子进行全扫描。在所用实验条件下，FAA主要产生m/z104.1、83.2、214.2、204.2等子离子；AAA主要产生m/z228.2、104.1、83.1、204.2等子离子：AA主要产生m/z83.1、159.1、94.1、187.2等子离子；MAA主要产生56.1、97.1、159.1等子离子；IPA主要产生125.1、56.1、96.1、153.1、204.2等子离子，各代谢物的二级质谱图见图14-7。

图14-7 安乃近代谢物的二级质谱图

4)定量方式的选择

采用LC-MS-MS对安乃近四种残留物(4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林、4-氨基安替比林和4-甲基氨基安替比林)进行分析时发现，4-甲酰氨基安替比林、4-乙酰氨基安替比林和4-氨基安替比林采用外标法进行定量能够得到理想的回收率。而4-甲基氨基安替比林通过外标法进行定量，其回收率相对较差，本方法在国家标准GBT 20747-2006的基础上选择IAA作为内标物，对MAA进行定量分析，其回收率能够满足残留分析要求，故对4-甲基氨基安替比林采用内标法进行定量分析。