16.1.4 残留分析技术

硝基咪唑类药物残留受到各国政府的关注，其残留检测方法研究较多，目前主要采用仪器分析方法。Polzer等8确定了火鸡服用硝基咪唑类药物后应该检测的目标化合物。比较了MNZ、RNZ、DMZ、IPZ及其相应的羟基化代谢产物MNZOH、HMMNI、IPZOH在火鸡各组织中的含量及稳定性。检测MNZ和RNZ时应该选择原药作目标化合物；在检测DMZ和IPZ时，应选择其代谢产物HMMNI和IPZOH作为目标化合物。

16.1.4.1 前处理方法

前处理中往往涉及浓缩吹干等步骤，本类药物蒸汽压较高，易被溶剂或气流带出损失，所以蒸发温度不宜过高，吹蒸速度不宜过快，不要将样品蒸干，应缓缓吹入氮气或空气。

(1)提取方法

提取是将生物样品中的残留药物通过适宜的溶剂转移出来，并尽量减少共萃取的样品基质。样品基质中硝基咪唑类药物及其羟基代谢物在常温下降解迅速，视网膜和血浆中样品稳定性比肌肉和肝脏中高，合理的方法还应该保证分析物的稳定性。早期研究将样品调节pH3，用蛋白酶过夜酶解提取与组织蛋白结合的残留物，但近期研究表明没必要酶解。

1)液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

由于该类药物的碱性性质，在酸性条件下溶于水，在碱性条件下溶于有机溶剂，组织提取物用酸性水溶液复溶后，可用二氯甲烷或正己烷除脂。硝基咪唑类药物的提取用乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷和甲苯等，溶剂极性不同，共萃取的杂质也不同，后续净化方法也不相同。其中应用乙腈和乙酸乙酯的报道最多，禽蛋类样品应用乙腈提取比乙酸乙酯更好，可以避免乳化现象。提取溶剂常加入适量的盐可促使溶剂与样品基质相分离，减少和沉淀共萃取物，其中氯化钠应用最多。提取液常用氮气吹至近干，该步骤很关键，因为过热和干燥可能导致分析物挥发。乙酸乙酯沸点相对较低，加入少量的高沸点溶剂如二甘醇(沸点241℃)作为保持剂，可防止因蒸发温度过高引起药物挥发损失。

A. 乙腈提取

乙腈沉淀蛋白效果较好，与水性基质互溶，是提取组织中硝基咪唑类药物常用溶剂之一。乙腈用于提取禽肉类样品，回收率在79%～93%之间。Wang等用乙腈提取禽肉中MNZ、DMZ和RNZ，回收率在80%～90%之间，变异系数(CV)小于14.3%。Thompson等用乙腈提取动物肾脏、肝脏、牛奶和禽蛋中6种硝基咪唑及其代谢物，经免疫传感器测定，DMZ、RNZ、IPZ的检测能力(CCβ)小于1μg/kg，DMZOH、IPZOH的CCβ小于3μg/kg，MNZ和MNZOH的CCβ小于2μg/kg，但未测定回收率。Cronly等用液相色谱-质谱(LC-MS)测定了牛奶和蜂蜜中的CNZ、TNZ、TIZ、ORZ、RNZ、DMZ、MNZ、IPZ、IPZOH、HMMNI和MNZOH。3g蜂蜜加5mL水，完全溶解混匀后，加10mL乙腈、2g氯化钠，振摇，离心，上清液用正己烷脱脂后测定；1mL牛奶用2mL乙腈、0.5g氯化钠提取，振荡离心后取上清液测定。以HMMNI-d3、MNZOH-d2、DMZ-d3、RNZ-d3作为内标定量。牛奶的回收率为90.8%～108.9%，检测限(CCa)和CCβ分别为0.41～1.55μg/L和0.70～2.64μg/L；蜂蜜中CCa和CCβ分别为0.38～1.16ug/kg和0.66～1.98ug/kg。

B. 乙酸乙酯提取

乙酸乙酯与组织也有一定相溶性，适用于提取中等极性药物，很多研究采用乙酸乙酯提取组织中硝基咪唑类药物，但需要注意的是乙酸乙酯提取液中往往含有较多的脂肪，脱脂净化步骤必不可少。Sun等用乙酸乙酯提取禽和猪肉中7种硝基咪唑(包括MNZ、RNZ、DMZ、TNZ、ORZ、SNZ以及RNZ和DMZ的共同代谢物HMMNI)。7种硝基咪唑类药物检测限(LOD)为0.2μg/kg，鸡肉、猪肉中药物回收率为71.4%～99.5%，CV分别为6.2%～13.9%和4.0%～8.7%。Zeleny等直接用乙酸乙酯提取猪肉中DMZ、MNZ、RNZ、MNZOH、IPZOH和HMMNI，提取液上清液蒸干后流动相复溶，进LC-MS测定，回收率为101%～107%，CCa和CCβ分别为0.29～0.44μg/kg和0.36～0.54μg/kg。黎翠玉等采用乙酸乙酯提取动物源食品中MNZ、DMZ和RNZ及其代谢物MNZOH、HMMN残留，LC-MS测定。方法回收率在61.1%～108.0%之间，相对标准偏差(RSD)为1.9%～6.3%，定量限(LOQ)为0.1μg/kg。Zhou等报道用乙酸乙酯提取蜂蜜中MNZ、RNZ、DMZ、TNZ和HMMNI的残留。MNZ、DMZ、RNZ、TNZ和HMMNI的LOD为1.0～2.0ng/g，平均回收率为71.5%～101.4%。刘玉芳等建立了高效液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)测定盐渍羊肠衣中2种硝基咪唑残留量。先用甲醇-丙酮均质，以乙酸乙酯萃取提取盐渍羊肠衣中硝基咪唑类残留物。测定出甲硝唑和洛硝哒唑的LOD均为0.5ng/mg，甲硝唑和洛硝哒唑的LOQ均为1.0ng/mg；在添加水平0.5ng/mg、1.0ng/mg、2.0ng/mg的回收率为62.7%～70.37%，RSD为3.4%～5.8%。在碱性条件下，本类药物以分子形态存在，易溶于有机溶剂，乙酸乙酯的提取效率提高。Sakamoto等提取鱼肉中MNZ、DMZ和RNZ残留。5g组织加入1g碳酸氢钠后用乙酸乙酯提取，LC-MS/MS测定。回收率为91.2%～107.0%，LOD为0.05～0.2μg/kg。丁涛等用4mL 0.25mol/L氢氧化钠溶液-乙酸乙酯将蜂王浆中MNZ、DMZ和RNZ提取至乙酸乙酯相。DMZ的LOQ为2.0μg/kg，MNZ和RNZ为1.0μg/kg；回收率和CV分别为96.6%～110.6%和2.1%～7.4%。

C. 二氯甲烷提取

二氯甲烷与乙酸乙酯化学性质相似，但二氯甲烷密度较大，提取完成离心后基质浮在提取液上方，后续操作应尽量减少二次污染。用二氯甲烷提取时加入无水硫酸钠可以吸去组织中的水分，使组织密度升高，离心时可以完全沉淀到试管底部，有利于后续操作；同时，硫酸钠盐析也可提高提取效率。Cannavan等根据基质特点，分别用二氯甲烷提取肌肉中的DMZ，用甲苯提取肝脏和禽蛋中DMZ。用D-DMZ内标，回收率为93%～102%，CV为1.2%～7.7%，绝对回收率接近80%，但甲苯对MNZOH的提取效率很低。高小龙用无水硫酸钠和二氯甲烷振荡提取鸡组织(肌肉、肝脏、肾脏、脂肪)中的MNZ和DMZ残留。组织中DMZ及DMZOH的LOQ均为1.0μg/kg；肌肉平均回收率在56.9%～76.5%之间，肝脏在63.3%～72.6%之间，肾脏在64.2%～73.3%之间，脂肪在63.5%～75.7%之间；日内CV均小于16%，日间CV均小于15%。

D. 其他溶剂提取

也有采用其他溶剂提取的报道。GB/T21318-2007测定猪肉、鸡肉、牛肉、猪肝、鸡肝、牛肝、猪肾、牛肾和鱼肉中4-硝基咪唑、IPZ、MNZ、RNZ、MNZ、CMNI、DMZ、苯硝咪唑及其代谢物MNZOH、HMMNI时，样品用硅藻土混匀，加饱和氯化钠、甲醇-丙酮(3+1，v/v)，再均质提取3min，离心后取上层液，LC-MS/MS测定。LOD达到0.5～1μg/kg，回收率为71.4%～115%。该提取过程类似于QuEChERS，相对较为简单。Semneiku等测定鸡血中的MNZ和DMZ残留，取1mL血清并加入20%的三氯乙酸甲醇溶液1mL，混合后离心，取上清液过滤膜后用高效液相色谱(HPLC)分析。血清中LOD为5ng/mL，回收率为82%～94%，CV小于10%。

2)超声辅助萃取(ultrasonic-assisted extraction，UAE)

UAE是利用超声波辐射压强产生的强烈空化效应、机械振动、扰动效应、高加速度、乳化、扩散、击碎和搅拌作用等多级效应，增大物质分子运动频率和速度，增加溶剂穿透力，从而加速目标成分进入溶剂，促进提取的方法。UAE适用于匀浆的组织和结构松散的样品(如蜂蜜、牛奶)。GB/T21318-2007测定奶粉和蜂蜜中的4-硝基咪唑、IPZ、2-甲硝唑、RNZ、MNZ、CMNI、DMZ、苯硝咪唑残留及其代谢物MNZOH、HMMNI时，用10mL饱和氯化钠水溶液和70mL甲醇-丙酮(3+1，v/v)超声波辅助提取30min，离心后取上层液体，经固相萃取净化，LC-MS/MS测定，LOD达到0.5～1μg/kg，回收率为71.4%～115%。

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