(6)液相色谱-质谱法(liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS)

随着LC与MS接口瓶颈解决，采用LC-MS技术测定硝基咪唑类药物的研究报道不断增多，主要有热喷雾电离源(TSI)、大气压化学电离源(APCI)和电喷雾电离源(ESI)三种离子化方式。LC-MS可分析GC-MS所不能分析的强极性、难挥发、热不稳定性的化合物，但在测定中内源性基质引起的离子抑制效应较为常见，通过改变质谱条件、提高色谱分离效能、应用合适的内标物可克服基质效应。

1)热喷雾电离源(TSI)

TSI是最早应用的LC-MS接口，但存在重复性差、定量效果差的缺点，现在已很少应用。Cannavan等建立了禽组织和蛋中DMZ的LC-MS测定方法。色谱柱为ODS3(250mm×4mmi.d.)，流动相为甲醇-0.05mol/L乙酸铵(1+1，v/v)，质谱采用TSI离子源接口，离子源和四极杆温度分别为250℃和100℃，SIM模式检测。方法LOD小于1ng/g，回收率为93%～102%。

2)大气压化学电离源(APCI)

APCI借助电晕放电启动气相离子化，形成单电荷的准分子离子，适合测定极性较小的化合物。Sams等研究了液相色谱-大气压化学电离-质谱(LC-APCI-MS)方法检测禽肉和蛋中DMZ、RNZ及其共同代谢物MNZOH。色谱柱为Prodigy ODS3柱(250mm×3.2mmid，5μm)，流动相为乙腈-0.05mol/L乙酸铵(13+87，v/v)，流速0.5mL/min，电晕放电电压3.22kV，高压透射电压(lensvoltage)0.0V，锥孔电压10V，锥孔电压偏移距5V，源温140℃，APCI探针温度500℃，正离子、SIM模式检测，每种物质检测2个离子。方法LOD为0.1μg/kg(DMZ、RNZ)和0.5μg/kg(MNZOH)；平均回收率为65%(DMZ)、87%(RNZ)和75%(MNZOH)，RSD分别为22%、11%和14%。殷居易等采用LC-APCI-MS/MS方法对肉中MNZ、DMZ、TNZ、RNZ的残留量进行分析。采用Waters Sunfire C18色谱柱分离，流动相为0.1%甲酸和0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，APCI源正离子监测，离子源雾化温度450℃，碰撞气(CAD)、气帘气(CUR)、雾化气(NEB)流量分别为6mL/min、6mL/min、12mL/min，多反应监测(MRM)模式检测。MNZ、DMZ、TNZ、RNZ的LOQ均0.2μg/kg，LOD为0.05μg/kg；猪、鸡肉、小龙虾去壳肉的平均回收率为73%～93%，日内、日间RSD小于10%。

3)电喷雾电离源(ESI)

ESI适用于极性较大的化合物，也是目前硝基咪唑类药物LC-MS分析采用最多的电离技术。Hurtaud-Pessel等建立了鸡肉中MNZ、RNZ、DMZ和HMMNI等4种硝基咪唑类药物的液相色谱-电喷雾-单四极质谱(LC-ESI-MS)分析方法。样品用乙酸乙酯萃取，除脂后进样分析。色谱柱为Waters Symmetry C18(150×3.9mmi.d，5μm)，流动相为乙腈-甲醇-0.2%甲酸(6+13+81，v/v)，流速0.6mL/min，ESI正离子、SIM模式检测，RNZ-d3为内标定量。方法LOD在5μg/kg以下，回收率在73%～97%之间，CV为17%～26%。Zeleny等采用LC-ESI-MS/MS测定猪肉中6种硝基咪唑类药物。用C18(150mm×3mmi.d.5μm)色谱柱分离，以10mmol/L甲酸铵(pH3.5)-乙腈(90+10，v/v)和10mmol/L甲酸铵(pH3.5)-乙腈(10+90，v/v)为流动相，梯度洗脱，流速0.4mL/min，ESI+电离，源温700℃，气帘气103.42kPa，喷雾气和涡轮气分别为344.74kPa、482.63kPa，喷雾电压2000V，MRM检测。方法回收率为101%～107%；CC和CCβ分别为0.29～0.44μg/kg和0.36～0.54μg/kg。黎翠玉等采用LC-ESI-MS/MS测定动物肉中MNZ、DMZ和RNZ三种硝基咪唑类化合物及两种代谢物MNZOH、HMMNI残留。色谱柱为AtlantisT3色谱柱(2.1mm×150mm，3μm)，流动相为水-乙腈，梯度洗脱，流速0.25mL/min，柱温30℃，进样量2μL，ESI电离源，离子源温度500℃，去簇电压70V，入口电压10V，出口电压13V，锥孔反吹气流量350L/h，脱溶剂气温度350℃，脱溶剂气流750L/h，正离子扫描，MRM检测。方法回收率在61.1%～108.0%之间，RSD为1.9%～6.3%，LOQ均为0.1μg/kg。Xia等还报道超高效液相色谱-电喷雾-串联质谱(UPLC-ESI-MS/MS)测定猪肾中6种硝基咪唑药物的方法。用Acquity BEHC18(50mm×2.1mmi.d，1.7μm)色谱柱分离，水-乙腈梯度洗脱，毛细管电压2.8kV，离子源温度110℃，去溶剂温度350℃，ESI正离子、MRM模式检测，同位素内标定量。方法LOD为0.005～0.5μg/kg，LOQ为0.1～0.5μg/kg，平均回收率为83%～111%，CV小于12%，每个样品测定时间仅需要4min。

Mottier等采用同位素内标法测定了鲜蛋、肉和鱼中DMZ、RNZ、MNZ和IPZ等4个硝基咪唑类药物以及羟基代谢物MNZOH和IPZOH。色谱柱为Symmetry Shield C18 (15cm×2.1mm，3.5um)，0.1%甲酸溶液和0.1%甲酸乙腈溶液为流动相，梯度洗脱，流速0.3mL/min，进样量30μL，Turbolon喷雾气和气帘气均为氮气，流速7.5L/min和10mL/min，离子源温度350℃，毛细管电压1.2kV，去簇电压20V，ESI电离，MRM检测，内标法定量。方法CCa为0.07～0.36μg/kg，CCβ为0.11～0.60μg/kg；鲜蛋、肌肉和加工蛋中的回收率为88%～111%。Xia等测定肌肉和禽蛋中MNZ、DMZ、RNZ和HMMNI残留。采用C8色谱柱分离，流动相为0.2%乙酸和乙腈，梯度洗脱，
LC-MS/MS检测，ESI+、MRM模式测定。禽蛋的回收率为50%～86%，LOD为0.05～0.25μg/kg；鸡肉回收率为66%～115%，LOD为0.07～0.27μg/kg；猪肉回收率为79%～11%，LOD为0.07～0.26μg/kg。

丁涛等用LC-MS/MS测定蜂王浆中MNZ、DMZ和RNZ残留。使用氢氧化钠溶液溶解样品，以乙酸乙酯提取后测定。采用Waters symmetry C18色谱柱(15mm×2.1mm.i.d.，5μm)分离，5mmol/L醋酸铵溶液和甲醇为流动相，梯度洗脱，ESI电离源，正离子检测，源内诱导解离电压(SID)10V，第一重四极杆分辨率(Q1)为0.4，利用高选择性反应监测(H-RSM)技术降低了基质干扰，氘代二甲硝唑为内标定量，增加了定量的准确性。DMZ的LOD为1.0μg/kg，LOQ为2.0μg/kg；MNZ和RNZ的LOD为0.5μg/kg，LOQ为1.0μg/kg；方法回收率为96.6%～110.6%，RSD为2.1%～7.4%。Sakamoto等采用反相C18色谱柱分离，甲醇-水为流动相，梯度洗脱，ESI+-MS/MS在选择反应监测(SRM)模式下检测，同位素内标(DMZ-d3、MNZ-C2，N2和RNZ-d3)定量，测定了蜂蜜和鱼肉中MNZ、DMZ和RNZ。平均回收率为91.2%～107.0%，LOD为0.05～0.2μg/kg。Cronly等用LC-ESI-MS/MS测定牛奶和蜂蜜中MNZ、DMZ、RNZ、IPZ及其羟基代谢物(MNZOH、HMMNI和IPZOH)，以及ORZ、TNZ、CNZ和TIZ等共11种硝基咪唑类药物。色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18(100mm×2mm，1.8μm)，柱温45℃，流动相为0.1%甲酸和0.1%甲酸乙腈溶液，梯度洗脱，流速0.5mL/min，MS/MS采用ESI模式检测。奶样品的CCa和CCβ分别为0.41～1.55μg/L和0.70～2.64ug/L，蜂蜜样品分别为0.38～1.16μg/kg和0.66～1.98μg/kg。GB/T20744-2006也采用反相HPLC，乙腈-甲酸溶液为流动相，串联质谱在ESI+、MRM模式下检测蜂蜜中MNZ、DMZ和RNZ残留。方法LOD为0.1～0.2μg/kg。
常见硝基咪唑类药物的LC-MS分析方法见表16-2。

表16-2 硝基咪唑类药物的LC-MS分析方法简表

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