(2)净化方法

PEs的净化方法主要有固相萃取(SPE)、液液分配(LLP)、基质固相分散(MSPD)、和免疫亲和层析(IAC)等，而SPE是采用最多的方法。

1)液液分配(liquid liquid partition，LLP)

LLP是一种根据待测组分与非待测组分在互不相溶的两相溶剂中溶解性不同而进行分离的经典净化方法。溶剂、pH以及加入的离子对试剂的不同都会影响LLP净化的效果。Moran等建立了牛可食性组织中MON的检测方法。组织样品用甲醇-水(850+150，v/v)提取，提取液中再加入50mL NaCl溶液(0.1g/mL)，与二氯甲烷进行LLP净化，收集二氯甲烷层，再经Sep-Pak硅胶柱净化后，高效液相色谱-柱后衍生化检测。可食性组织的LOQ为25μg/kg，回收率在80%～88%之间。Blanchflower等采用甲醇提取家禽肌肉、肝脏和鸡蛋中MON、SAL及NAR，超声10min，离心后取上清液，加入0.1mol/L氢氧化钠溶液4mL，再向混合提取液中加入等体积的甲苯-己烷(1+2，v/v)再次提取药物，取有机层在60℃下氮气吹干，乙腈-水溶液复溶，供液相色谱质谱分析。方法回收率在77%～113%之间，CV小于15%；线性范围在1～400ng/mL之间，LOD低于1ng/g。

2)固相萃取(solid phase extraction，SPE)

SPE用途广泛，而且越来越受残留分析工作者的青睐。SPE法的关键在于选择合适的吸附剂类型及各种溶剂的用量。PEs净化常用的SPE吸附剂有硅胶、弗罗里硅土(Florisil)、石墨化碳黑、HLB共聚物和C18等。

A.硅胶柱

Matabudul等建立了检测动物肝脏和鸡蛋中5种PEs的残留的方法。向组织中加入无水硫酸钠脱水后，乙腈作为提取剂提取，提取液在重力作用下过硅胶SPE柱净化，再用2mL乙腈洗涤，收集全部留出液，40℃下蒸发浓缩至1mL，0.45um滤膜过滤后，供液相色谱-串联质谱分析。禽肝脏和蛋中药物的平均回收率分别在92%～118%和86%～110%之间，方法LOD为1ug/kg，LOQ为2.5ug/kg。Ward等用异辛烷～乙酸乙酯(90+10，v/v)提取鸡可食性组织(肝脏、肌肉、肾脏、皮肤+脂肪)中的NAR，提取液经无水硫酸钠脱水后，过硅胶SPE柱净化，用二氯甲烷洗涤，二氯甲烷-甲醇(90+10，v/v)洗脱，洗脱液氮气吹干后，用甲醇-水(90+10，v/v)复溶，过滤后，再用液相色谱检测。方法线性范围在0.125～1.0μg/mL之间，所有组织平均回收率在80.7%～89.0%之间，方法LOD为2.85ng/g，LOQ为7.04ng/g。张素霞等建立了肉鸡肌肉、肝脏和脂肪中MON和SAL的高效液相色谱柱后衍生-可见光检测方法。样品组织经异辛烷提取后，用硅胶SPE柱净化，淋洗液为二氯甲烷，洗脱液为二氯甲烷-甲醇(90+10，v/v)，收集洗脱液浓缩后，用甲醇-水溶解，高效液相色谱测定。MON和SAL的LOD分别为0.05μg/g和0.1μg/g，MON和SAL在肌肉、肝脏和脂肪组织中的平均回收率分别为97.7%、91.1%、92.1%和94.1%、85.4%、90.7%，CV在2.7%～16.8%范围内。陈笑梅等测定鸡肉中MON残留，样品采用甲醇-水(85+15，v/v)搅拌，超声波辅助萃取5min，提取液过滤到分液漏斗中，再用二氯甲烷-NaCl溶液LLP，下层溶液通过无水硫酸钠柱收集到平底磨口烧瓶中，45℃下浓缩至干，用二氯甲烷复溶后过Sep-Pak硅胶小柱进一步净化(预先用3mL二氯甲烷浸润)，洗脱液为5mL二氯甲烷-甲醇(95+5，v/v)。采用高效液相色谱-柱后衍生法测定。方法回收率为88.1%～101.3%，LOQ为0.02mg/kg。我国农业部于2001年发布了动物源食品中MON和SAL的残留检测方法标准，采用高效液相色谱-柱后衍生紫外法测定鸡肌肉、脂肪、肝脏和肾脏中MON和SAL的残留。试样用异辛烷提取，过硅胶SPE柱净化，洗脱液为二氯甲烷-甲醇(90+10，v/v)，高效液相色谱测定。MON和SAL的LOD分别为50μg/kg和100μg/kg；在100μg/kg添加浓度水平的回收率为80%～110%，批内CV≤10%，批间CV≤15%。

B.弗罗里硅土柱

吴荔琴等建立了鸡组织中MAD的高效液相色谱荧光检测法。肌肉、肝脏样品用异辛烷提取，皮肤/脂肪样品用乙腈提取，提取液在(40±2)℃水浴下蒸干，异辛烷复溶，用经异辛烷活化的弗罗里硅土SPE柱净化，二氯甲烷淋洗，甲醇-二氯甲烷(1+9，v/v)洗脱，洗脱液在氮气下吹干后，用乙腈复溶，衍生化后，供高效液相色谱分析。方法线性范围为0.15～7.2μg/mL，组织添加回收率均大于70%，LOQ为30μg/kg。

C.石墨化碳黑柱

毕言锋等建立了同时测定了鸡肉中MON和SAL残留的超高效液相色谱-串联质谱方法。乙腈提取液过预先经二氯甲烷和乙腈活化的石墨化碳黑SPE柱净化，提取液上柱后保持滴下速度为2～3mL/min，用二氯甲烷-甲醇(80+20，v/v)洗脱，40℃下氮气吹干，乙腈-水(90+10，v/v)复溶，用超高效液相色谱-串联质谱测定。MON和SAL的LOD为0.2μg/kg，LOQ为0.5μg/kg；回收率为71.9%～95.1%，批内和批间CV均小于15%。

D. HLB柱

Nasz等建立并验证了牛奶中11种抗球虫药的液相色谱-串联质谱检测法。样品用乙腈提取，提取液用预先经乙腈和水活化的Oasis HLB柱净化，用水洗涤，乙腈洗脱，液相色谱-串联质谱测定。其中，LAS回收率在93.2%～113.9%之间，LOD和LOQ分别为0.05μg/kg和0.5μg/kg。Olejnik等建立了检测鸡蛋中抗球虫药的液相色谱-串联质谱验证方法，验证的分析物有LAS、MAD、MON、NAR、SAL、SEM等抗球虫药。样品用乙腈提取，提取液在50℃下氮吹至约1mL，加水稀释并离心后，将上清液过Oasis HLB SPE柱(预先用2mL甲醇和2mL水活化)净化，甲醇洗脱，50℃吹干后用乙腈-水(50+50，v/v)复溶，液相色谱-串联质谱检测。该方法符合欧盟要求，检测限(CCa)在2.92～ 178μg/kg范围，实验室内再现性CV在6.1%～29.3%之间；LOD和LOQ分别为0.04～2.62μg/kg和0.12～7.54μg/kg，回收率在90.4%～111.7%之间。

E. C18柱

Aguilar-Caballos等建立了鸡肝脏中LAS的铽(II)增敏发光检测法。组织样品用乙醇-36%盐酸溶液超声辅助萃取，过滤提取液后用水稀释，过C18柱净化，70%乙醇洗脱。采用SLM-Aminco Miliflow停流装置连接SLM-Aminco Model 8100光子计数荧光光谱仪检测。鸡肝脏中LAS的回收率在95.9%～104.9%之间，LOD达2ng/g。Rosen建立了鸡肝脏和鸡蛋中PEs离子载体抗生素类药物的液相色谱-串联质谱检测法。样品用87%甲醇提取后，采用自动净化步骤，SPE柱为Isolute MF C18(100mg，预先用甲醇和水活化)，80%甲醇洗涤，洗脱液为甲醇，液相色谱-串联质谱分析。鸡蛋中LAS精确度在94%～108%之间，相对标准偏差(RSD)在4%～10%之间，LOD为0.026ug/kg。

F.复合用柱

Martinez等建立了牛肝脏组织中MON、SAL、NAR和LAS的液相色谱定量检测方法。用甲醇-水(8+2，v/v)作为提取液，过氧化铝SPE柱净化，用甲醇-水(8+2，v/v)洗涤，收集所有流出液与5% NaCl溶液混合，用二氯甲烷进行LLE提取，收集下层二氯甲烷溶液，48～50℃旋转蒸干，再用甲醇-水(8+2，v/v)复溶后过Sephadex LH-20柱(预先用甲醇-水提取液活化)，收集流出液，氮吹至干。用9-蒽基重氮甲烷(ADAM)衍生化后再用硅胶柱净化(预先用己烷湿润，洗脱液为甲醇)，高效液相色谱-荧光检测。方法LOD为0.15mg/kg，线性范围为0.5～5.0mg/kg，平均回收率除LAS为57%外，其他均在70%～90%之间。宫川弘之等建立了同时检测鸡组织中MON和SAL的残留分析方法。用乙腈提取，提取液过滤后，用乙酸乙酯和水进行LLP净化，乙酸乙酯层在氮气下吹干后用氯仿复溶，再过Sep-pak硅胶SPE柱净化，淋洗液为10mL(肝脏20mL)氯仿-乙酸乙酯(9+1，v/v)，用5mL氯仿-甲醇(9+1，v/v)洗脱，洗脱液氮气吹干，用1-溴乙酰芘(1-BAP)使SAL和MON生成荧光衍生物，氯仿溶解，再过Sep-pak弗罗里硅土柱净化，用乙酸乙酯淋洗，丙酮-水(9+1，v/v)洗脱，洗脱液氮气吹干后，用甲醇复溶，高效液相色谱荧光检测器测定。方法添加回收率在66.2%～96.2%之间，LOD为50μg/kg。Olejnik等建立了同时检测禽肝脏中12种抗球虫药(包括LAS、SAL、MON、NAR、MAD和SEM)的液相色谱-串联质谱方法。用乙腈提取，向提取液中加入1mL水，混合液用预先经1mL乙腈冲洗活化后的中性氧化铝柱脱脂净化，再过经2mL甲醇和2mL水活化的Oasis HLB柱净化，用1mL水淋洗，真空抽干30s，再用2mL已烷淋洗，真空抽干10min后，用2mL已烷淋洗，2×2.5mL甲醇洗脱，供液相色谱-串联质谱测定。方法回收率在81.2%～120.1%之间；除LAS的LOD为10.9μg/kg外，其他5种PEs的LOD在0.27～2.77μg/kg之间。由于LAS在氧化铝柱上非重现性保留，LAS的重现性低于50%，这一现象Vincent等也有提及。

3)基质固相分散萃取(matrix solid phase dispersion，MSPD)

MSPD是20世纪80年代末兴起的一种样品处理技术。将固态或液态的样品直接与适量的反相键合硅胶混合并研磨，使样品均匀地分散于固相颗粒的表面后，制成半固态装柱，再对其进行与普通SPE类似的淋洗或洗脱等操作，以实现提取和净化一步进行。MSPD技术具有处理样品速度快、溶剂用量少等特点。Nasz等建立并验证了牛奶中11中抗球虫药的液相色谱-串联质谱检测方法。MSPD所用吸附剂为Isolute C18(EC)，将2g吸附剂与0.5mL牛奶样品混合匀浆，装入一个底部带滤器的注射器筒，洗脱后将洗脱液收集并在氮气下吹干，用500μL乙腈-水(50+50，v/v)复溶，用液相色谱-串联质谱检测。经比较，LAS、MAD、MON和NAR洗脱液为乙酸乙酯时效果最好，其次为甲醇。方法回收率在77.1%～118.2%之间，经验证满足欧盟委员会决议2002/657/EC要求。

4)免疫亲和色谱(immunoaffinity chromatography，IAC)

IAC根据与惰性固定相连接的抗体对某种或某类残留组分的选择性吸附的原理，对复杂基质样品进行有效净化的一种方法，现已广泛应用于多种药物残留的测定。Ra等建立了鸡肉中SAL和NAR的液相色谱分析法。鸡肉样品用乙腈提取，提取液用PBS稀释后，过偶联抗SAL抗体的IAC柱进行净化。在重力下，滴速保持1滴/s，先后用PBS和水洗涤，甲醇-水(90+10，v/v)洗脱，洗脱液氮气吹干后用500μL甲醇复溶，再用液相色谱-柱后衍生化检测。SAL和NAR日内平均回收率分别在87.5%～93.1%和86.2%～94.3%之间，CV分别为4.7%～6.2%和2.4%～5.7%；日间平均回收率分别在86.0%～93.0%和86.0%～92.1%之间，CV分别为4.8%～6.5%和5.8%～7.4%；方法LOD均为2.5ng/g。Godfrey等通过酶水解作用从鸡组织中提取MON。首先将1mL木瓜蛋白酶加入均质后的组织中，旋涡混合5s，37℃下孵育16h，60℃下再孵育1h，离心后取上清4℃贮存；再用IAC净化，该免疫吸附剂由MON抗血清固定于多孔硅上制备，净化前用PBS、乙醇和洗脱液灌注IAC柱，真空辅助溶液流下，上样后用PBS和1%乙醇淋洗，洗脱液为含0.03mol/L盐酸和1%(v/v)乙醇的饱和Na2EDTA溶液，最后用化学发光酶联免疫吸附定量测定。鸡不同组织中MON的LOD范围在0.09μg/kg(肝脏)和1.99μg/kg(皮肤)之间，肝脏和皮肤的回收率分别为101.05%±10.67%和80.99%±0.19%。该IAC柱可以重复灌注再次使用。