20.2.1.7 分析条件的选择

(1)提取方法选择

本方法对比了用甲醇、乙腈、乙酸乙酯作为提取溶剂的回收率。

1)用甲醇作为提取溶剂

称取5.0g(精确至0.01g)牛乳样品于50mL离心管中，滴加5mol/L盐酸调至pH约为4.6，并记录盐酸消耗量。加入15mL甲醇，涡旋混匀1min，置于50℃水浴30min，超声波提取10min，以4000r/min离心10min。取上清液10mL，待净化。

2)用乙腈作为提取溶剂

称取5.0g(精确至0.01g)牛乳样品于50mL离心管中，加无水硫酸钠约3g和乙腈15mL，旋紧盖子，涡旋混匀1min，振荡10min，以3000r/min离心3min。移取.上层乙腈10mL，40℃水浴减压浓缩近干，用5mL甲醇-水(1+1，v/v)溶解残渣，待净化。

3)用乙酸乙酯作为提取溶剂

称取5g(精确至0.01g)牛乳样品于50mL离心管中，无水硫酸钠约3g和乙酸乙酯15mL，旋紧盖子，涡旋混匀1min，振荡10min，以5000r/min离心10min。移取上层乙酸乙酯层于圆底烧瓶中，再加入乙酸乙酯10mL，重复上述步骤，合并乙酸乙酯层40℃水浴减压浓缩近干，用于SPE净化。

按照上述三种提取方法测定添加浓度为10μg/kg的牛奶样品中聚醚类抗生素回收率，每种方法做3个平行测定，见表20-5。对比试验结果表明，用乙腈作为提取溶剂，基质背景相对干净，基线噪音低，对提高检测灵敏度效果明显，提取效率高稳定，故选用乙腈作为提取溶剂。在加入无水硫酸钠的条件下，涡旋混匀后，用超声波提取10min，获得稳定、满意的回收率。

(2)净化方法的选择

牛奶和奶粉样品提取溶液的净化，文献方法主要是固相萃取法，也有未净化直接进样的。本试验对比研究了用正己烷液液萃取除脂法、SPE法和GPC的净化效果。牛奶类样品基质复杂，尤其是配方奶粉中，存在多种维生素等添加成分，采用液-液萃取法净化，不足以去除奶粉中的干扰物质;聚醚类抗生素分子量分布范围较宽(MW 612-934)，采用GPC净化的收集时间长，与脂肪有共流出时段，净化效果不够理想;本方法采用正己烷除脂后，Oasis HLB固相萃取柱净化，有效去除了杂质干扰，回收率均在85%～105%之间。

表20-5 比较三种提取方法的回收率(添加浓度为10μg/kg)

(3) 液相色谱-串联质谱分析条件的确定

1) 优化质谱分析条件、确定母离子和监测离子

采用注射泵直接进样方式，以10μL/min将聚醚类抗生素的标准溶液注入串联质谱的离子源中。采用正离子扫描方式进行-级质谱分析，在选定的质谱条件下，聚醚类抗生素的产生稳定的强峰,确定了母离子(尼日利亚菌素母离子为[M+NH4]+，其余5种抗生素母离子均为[M+Na]+)，优化了电离电压。对被测物的准分子离子碰撞后，进行二级质谱分析，得到子离子质谱图，选择了监测离子，确定子离子丰度，优化了碰撞能量。还对离子源温度、脱溶剂气温度、脱溶剂气流量、锥孔反吹气流量等参数进行了优化。锥孔电压、碰撞能量和驻留时间等质谱参数及母离子和子离子详见表20-2。六种聚醚类抗生素的一级质谱图和二级质谱图见图20-7至图20-12。

图20-7 拉沙洛菌素一级质谱(左)和二级质谱(右)图

图20-8 莫能菌素一级质谱图(左)和二级质谱图(右)

图20-9 尼日利亚菌素一级质谱图(左)和二级质谱图(右)

图20-10 盐霉素一级质谱图(左)和二级质谱图(右)

图20-11 甲基盐霉素一级质谱图(左)和二级质谱图(右)

图20-12 马杜霉素一级质谱图(左)和二级质谱图(右)

2) 色谱条件的确定

根据文献报道，选用通用性较强的BEH C18(1.7um，50mm×2.1mm)色谱柱，对混合标样进行梯度洗脱，六种成分能得到很好的分离。用甲醇+水(含0.1%甲酸)为流动相，采用简单的梯度洗脱模式，能使六种成分得到较好的分离，但峰型不对称，有些拖尾，在水系流动相中加入5mmol/L乙酸铵后，峰形得到有效改善。确定的流动相组成为：A为甲醇，B为0.1%甲酸+5mmol/L乙酸铵水溶液，梯度洗脱。

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