21.1.4 残留分析技术

21.1.4.1 前处理方法

动物源食品基质主要包括动物组织、牛奶、水产品等，成分复杂，在对残留AVMs进行分析测定前，一般需要进行样品前处理，将痕量AVMs从复杂基质中富集出来。

(1)提取方法

在样品提取前，必须进行充分的均一化，以保证样品的代表性。在加入溶剂提取时，多数是使用均质器进行提取，以保证提取效率。AVMs常用的提取方法主要有液液萃取(LLE)、加压溶剂萃取(PLE)、分散液液微萃取(DLLME)和超临界流体萃取(SFE)。

1)液液萃取(liquid liquid extraction，LLE)

鉴于AVMs的高脂溶性，可用多种有机溶剂进行提取，水溶性的有机溶剂如乙腈、甲醇，与基质的互溶性较好；乙酸乙酯、异辛烷也有采用。

杨君宏等采用乙腈振荡提取牛肌肉组织中的AVM、IVM和EPR，酶联免疫(ELISA)试剂盒测定。空白牛肌肉组织中以5ng/g、10ng/g和20ng/g浓度添加时，AVMs回收率为70.9%～108.6%，变异系数(CV)为3.7%～17.1%。王亮用乙腈高速(10000r/min)匀浆提取牛肉中IVM残留，沉淀物用乙腈重复提取，经固相萃取净化后，高效液相色谱法(HPLC)测定。方法检出限(LOD)为0.05μg/mL，在1～100μg/mL范围内，回收率在75.9%～96.3%之间。郑卫东等建立了猪肝脏中AVM和IVM残留量的检测方法。猪肝样品均质后用乙腈提取，固相萃取柱净化后，采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测。该方法LOD均为2.0ug/kg，定量限(LOQ)为5.0ug/L；在添加水平2～20μg/kg范围，AVM和IVM的平均回收率分别为77.0%～83.3%和76.9%～79.8%，相对标准偏差(RSD)分别小于12.1%和13.0%。卢志晓等采用乙腈提取冻虾中AVM、IVM、DOR和EPR残留，超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)测定。4种分析物在2μg/kg、10μg/kg、20μg/kg加标水平的平均回收率为75.1%～92.5%，RSD为6.78%～9.89%；四种AVMs的LOD均可达到0.5μg/kg。贾方等用乙腈提取牛筋样品中的AVM和IVM，经固相萃取柱净化和衍生化后，用HPLC分析。AVM和IVM的LOD分别为2.5～4.0ng/g；在3个加标浓度水平下，AVM和IVM的回收率在81.6%～101.0%和101.5%～102.4%之间，RSD均不大于2.0%。

程林丽等用乙腈提取牛奶中残留的AVM、IVM、DOR和EPR，加水和微量三乙胺稀释，固相萃取柱净化，氮气吹干并衍生化后，用HPLC测定。在2～1000ug/kg添加范围，各药物的回收率为70.2%～110.4%，批内CV为3.9%～8.2%，批间为5.1%～8.2%；EPR、AVM、DOR和IVM的LOD依次为0.5μg/kg、0.5μg/kg、0.4μg/kg和0.2μg/kg，LOQ依次为1.8μg/kg、1.6ug/kg、1.3μg/kg和0.8μg/kg。石艳丽等用乙腈作为血浆中蛋白质的沉淀剂和DOR的提取剂，离心后上清液旋转蒸干，固相萃取净化后，HPLC测定。方法LOD为0.1ng/mL；样品的回收率为89.5%～95.67%，不同浓度水平的日内CV和日间CV分别小于4%和5%。汪芳等建立了犬血浆中SEL含量的检测方法。用乙腈作为血浆蛋白沉淀剂，固相萃取柱进行净化，HPLC检测。方法的LOD为0.25ng/mL，CV为1.47%～3.31%，样品平均回收率为94.0%。

张文娟等建立了10种食品基质中AVM、IVM、DOR、EPR、MOX和SEL的残留分析方法。采用乙腈提取，经固相萃取净化后，UPLC-MS/MS测定。3个添加水平下，6种药物的回收率在60%～99%之间，RSD为0.2%～8.9%；6种药物的LOQ均达5.0μg/kg。张睿等建立了同时检测动物源性食品中的AVM、IVM、DOR、MOX残留量的方法。样品经乙腈提取，固相萃取小柱净化和衍生后，再用HPLC进行检测。方法LOD达到0.001mg/kg，回收率在92%～101%之间。

杨君宏等采用甲醇震荡提取牛肝中的AVM、IVM和EPR，ELISA试剂盒测定。空白牛肝脏组织中以20ng/g、50ng/g和100ng/g浓度添加时，AVMs回收率为53.8%～80.4%，CV为3.4%～17.9%。Massarollo等建立了蜂蜜中AVM的测定方法，采用甲醇-乙酸乙酯-正已烷提取，固相萃取净化后，HPLC测定。方法回收率为73.4%～97.45%，RSD在0.91%～13.7%之间；LOD和LOQ分别为0.002和0.007mg/kg。

徐英江等研究了水产品中IVM、AVM、EPR、DPR的分析方法。样品用异辛烷进行提取，经液液萃取净化和衍生后，HPLC检测。所有药物的LOD均能达到1.0μg/kg。在添加1～50μg/kg浓度范围，平均回收率为78.9%～106%，RSD为5.8%～11.2%。Hino等采用异辛烷提取牛组织中的AVM及其代谢物、IVM、EPR、DOR和MOX残留，LC-MS/MS测定，基质匹配标准曲线定量。方法回收率在87.9%～99.8%之间，日内精密度为1.5%～7.4%，日间为1.5%～8.4%。

2)加压溶剂萃取(pressurized liquid extraction，PLE)

PLE是指在较高的温度(50～200℃)和压力(1000～3000psi或10.3～20.6MPa)下，用溶剂萃取固体或半固体样品的新额的样品前处理方法。与传统提取方式相比，PLE速度快、溶剂用量少、萃取效率高、待测组分回收率好，可实现全自动安全操作。Xia等采用加压溶剂萃取(PLE)提取牛组织中的4种AVMs。以乙腈-水(40+60，v/v)为提取溶剂，在100℃、10MPa下两个静态周期提取3分钟，提取液经固相萃取净化和衍生后，HPLC检测。该方法回收率为84.8%～101.8%，RSD小于10.8%；LOD和LOQ分别为0.1～0.2μg/kg和0.5～0.6μg/kg。

3)分散液液微萃取(dispersive liquid liquid microextraction，DLLME)

DLLME是2006年才问世的一种新型微萃取技术。它基于使用微量注射器将微升级萃取剂快速注入样液内，在分散剂-水相内形成萃取剂微珠，很大地扩展了有机萃取剂和水样之间相接触面，大大加快了萃取平衡的速度，使目标化合物迅速萃入萃取剂微珠内，提高了萃取效率和富集倍数。Campillo等采用DLLME提取奶中的EPR、AVM、DOR、MOX和IVM。样品采用三氯乙酸溶液沉淀蛋白，再用2mL乙腈-氯仿(9+1，v/v)提取，HPLC和LC-MS/MS测定HPLC方法的LOQ为1.0～4.7ng/g，LC-MS/MS为0.1～2.4ng/g；在0.5～50ng/g添加浓度范围，方法回收率为89.5%～105%，RSD小于9%。

4)超临界流体萃取(supercritical fluid extraction，SFE)

SFE是20世纪70年代末发展起来的一种新型物质分离技术，它是-种利用超临界状态下的流体作为提取剂进行萃取的方法，与传统萃取法相比离效率高，可通过改变温度、压力或添加少量的有机溶剂，优化萃取过程，提高提取效率。超临界流体CO2的使用相对较多，具有低毒、低成本、易处理、化学稳定性好、易于达到临界参数(临界温度31℃，临界压力74bar)等特点。SFE能同时完成萃取和分离，其分离效率高，操作周期短，传质速度快，溶解力强，选择性高，且不污染环境。Danaher等报道了采用SFE技术提取净化动物肝脏中AVM、IVM、EPR、DOR和MOX残留的分析方法。将2.5g匀浆后的样品与4g硅藻土混匀，脱水干燥后，放入两端封有聚丙烯棉和2g碱性氧化铝的萃取池。在100℃、300bar下用超临界CO2萃取，流速5L/min、AVMs被在线碱性氧化铝阱吸附，再用4mL甲酸-乙酸乙酯(70+30，v/v)洗脱，60℃下氮气浓缩，衍生后，用HPLC测定。在4μg/kg和20μg/kg添加浓度，该方法平均回收率为76%和97%，日内和日间RSD分别小于10%和16%；LOQ达到2ug/kg。该方法还被用于猪肝和羊肝的分析。Brooks等采用SFE方法提取动物组织中的AVM时，在超临界流体CO2中加入9%改性剂-乙二醇甲醚(2-methoxyethanal，EGMME)，以提高萃取效率。在22ng/g添加浓度下，没有发现干扰物。

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