17.1.4.2 测定方法

BMZs的测定方法主要有生物学方法、免疫检测法和仪器检测法。生物学方法和免疫检测方法快捷、简便、灵敏，但易产生较高的假阳性率，仅作为筛选方法。仪器检测法主要是色谱技术与通用检测器，如紫外检测器(UVD)、荧光检测器(FLD)或质谱(MS)联用，是目前BMZs残留分析的主要技术手段。其中，MS是欧盟2002/657/EC决议中规定使用的确证方法，可进行定性、定量检测。

(1)生物学方法

生物学测定BMZs的方法主要用于日常评估食品中潜在的驱虫药。生物学测定通常的做法是，首先在薄层色谱(TLC)平板上分离残留物，然后在平板上依次喷上营养琼脂和含有指示生物的溶液，若TLC平板上出现抑制带，则表明有BMZs残留，抑制带的大小与BMZs残留的浓度相关。Rew等建立了一种用猪蛔虫幼虫多孔筛选分析TBZ、ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2和MBZ的方法。不同的药物和浓度对不同发育阶段(L2～L4)幼虫的作用不同，L2确定为幼虫的虫卵孵化阶段，L3为第一次蜕皮，L4为第二次蜕皮。所有药物残留物在10ng/mL时能够抑制L2～L3阶段的幼虫，L3～L4阶段的幼虫也能被BMZs抑制。这种幼虫抑制与BMZs的类型和浓度高度相关。ABZ、MBZ、TBZ、ABZ-SO和ABZ-SO2的抑制浓度分别为10ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、100ng/mL和1000ng/mL。生物分析方法作为食品中BMZs残留检测的筛选方法是较廉价的，但试验生物对BMZs代谢物或残留标示物敏感性的变化是关键问题，还需要进-一步研究。

(2)免疫分析法(immunoasay，IA)

免疫分析方法简单、灵敏、选择性好，常用于测定生物基质中BMZs残留。在某些情况下，采用免疫学方法分析血浆、血清和牛奶等样品，可以直接测定或稀释后测定。目前采用的免疫分析主要有放射免疫分析法、酶联免疫法和免疫传感器方法。

1)放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)

RIA早期被用于测定动物组织中BMZs残留。Nerenberg等建立了测定血浆中OFZ残留的RIA分析法。在水溶性碳化二亚胺偶联剂(EDC：HCI)中，将OFZ通过碳化二亚胺反应偶联到聚赖氨酸载体，免疫兔子，制备多克隆抗体。将缓冲液、标记物、标准品、未知物、抗血清等加入试管中漩涡混合，密封后在水浴40℃下过夜孵化，降温后进行添加，离心，取上清液转移至闪烁瓶，加入闪烁液，用闪烁光谱仪进行液体闪烁计数。该方法的LOD为200pg/mL，重复试验的标准误差(SD)为5%。

2)酶联免疫分析法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)

近年来，ELISA逐渐取代了RIA，在BMZs残留分析中得到了广泛应用。Brandon等将TBZ和TBZ-5-OH偶联到牛血清白蛋白(BSA)上制备免疫原，免疫小鼠产生单克隆抗体，建立了测定肝组织中TBZ的竞争性ELISA法。虽然用TBZ-5-OH偶联物制备的抗体特异性低，但对CAM和TBZ-NH2显示出很好的交叉反应性能；研究发现抗体对BMZs的交叉反应性并不在噻唑环上，所以对ABZ、MBZ和FBZ交叉反应较小。该方法LOD小于20ng/mL，平均回收率为97%，CV为17%。随后，该作者又用琥珀酰胺连接ABZ到BSA载体蛋白，免疫小鼠，制备出了单克隆抗体，对11种氨基甲酸酯类BMZs显示出很好的交叉反应性，包括ABZ、FBZ、OXI、MBZ、FLU、MBZ和一些代谢物，但对噻唑类BMZs(TBZ、CAM和TBZ-5-OH)没有交叉反应。该ELISA方法对ABZ及其代谢物的LOD为58ug/kg。Moran等采用新的免疫原(5-苯并咪唑羧酸)偶联到脂肽Pam；Cyst-TH制备出鼠单克隆抗体，这种抗体能够用来建立测定组织中与蛋白结合的TBZ代谢物的ELISA方法，但没有实际应用的介绍。陈飞等应用竞争ELISA技术，建立了一种快速检测动物组织中BMZs多残留的方法，并对其技术性能进行了评价。该方法的半数抑制浓度(IC50)浮动范围为0.9～1.5μg/L，动物组织样本的LOD为8μg/kg；样本添加回收率为79.8%～100.5%，CV为7.2%～9.5%。

3)表面等离子体共振技术(surface plasmon resonance，SPR)

表面等离子共振技术是20世纪90年代发展起来的一种生物分子检测技术，是基于SPR检测生物传感芯片上配体与受体相互作用的一种传感器技术，是利用金属膜/液面界面光的全反射引起的物理光学现象来分析分子相互作用。SPR传感器与传统检测手段比较，具有无标记，实时监测，灵敏度高等突出优点。所以，在医学诊断，生物监测，生物技术，药品研制和食品安全检测等领域有广阔的应用前景。

Keegan等建立了牛奶中11种氨基甲酸酯类BMZs残留的SPR检测方法。该方法采用多克隆抗体建立，该抗体是由5(6)-羧戍基硫基-2-苯并咪唑氨基甲酸酯蛋白偶联物制备的。前处理方法采用改进的QuEChERS方法。该方法的LOD为2.7ug/kg，11种药物的平均回收率为81%～116%。该作者还建立了两种SPR筛选方法，检测肝脏组织中11种氨基甲酸酯类BMZs和4种氨基BMZs兽药残留。方法基于羊多克隆抗体，样品用乙腈提取，氨基甲酸酯类BMZs用C18吸附剂净化，氨基BMZs直接用环已烷除脂净化，SPR测定。氨基甲酸酯类BMZs的LOD为32ug/kg，平均回收率为77%～132%；氨基BMZs的LOD为41μg/kg，平均回收率为103%～16%。Johnsson等也将5(6)-羧戊基硫基-2-苯并咪唑氨基甲酸酯蛋白偶联物制备的多克隆抗体用于SPR分析，测定牛血清中BMZs残留。该方法显示对ABZ、FBZ-SO2、MBZ、FBZ和OXI等5种BMZs具有较好的交叉反应性(>74%)。用20个空白血清样品测定的LOD和LOQ分别为2.6和4.8μg/kg。研究评估了不同样品处理方法对传感器响应的影响，发现用没有沉淀蛋白的血清制备的标准曲线，同用缓冲溶液制备的标准曲线并不一致。

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