(3)高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)

BMZs及其代谢物理化性质不同，HPLC同时分离多种BMZs有一定的困难，需要解决包括分辨率、峰形、峰锐度和合理运行时间等一系列问题。BMZs残留检测的HPLC方法主要采用反相色谱柱(C8或C18)、硅胶柱或阳离子交换柱，使用醋酸铵缓冲液-乙腈-甲醇混合液等作为流动相体系。BMZs有强的紫外发色团，适用于UVD检测；ABZ、FLU、TBZ及其代谢物还有荧光发色团，适于进行高灵敏和高选择性的FLD检测。Le Boulaire等测定组织中TBZ、MBZ时，发现TBZ荧光信号比紫外信号灵敏20倍，但是其余BMZs不具有天然荧光发色团，因此FLD不如UVD应用广泛。

1)紫外检测器(ultraviolet detector，UVD)

A.组织

张素霞等建立了牛肝中3种BMZs的HPLC法。牛肝组织样品经乙酸乙酯提取，正己烷除脂，然后C18 SPE净化，甲醇-磷酸二氢铵缓冲液(60+40，v/v)为流动相，C18柱分离，UVD检测，检测波长为295nm。牛肝中4个添加水平的平均回收率为78.8%，平均CV为2.18%，3种药物的LOD为8μg/kg，LOQ为25μg/kg。Danaher等用UVD在298nm检测了肝组织中14种BMZs残留。用未修饰的超临界CO2从添加样品中提取BMZs，用中性氧化铝柱和SCX柱净化提取物，再用HPLC-UVD检测。用C18色谱柱分离，流动相为pH6.8磷酸二氢铵-甲醇-乙腈混合液梯度洗脱。除TBZ、CAM和TCB-SO2不能定量外，其余11种BMZs的平均回收率在51%～113%之间，LOD为50μg/kg，日内及日间CV分别小于10%和32%。Rose等用乙腈提取肝组织中9种OFZ代谢物，经乙酸处理后，过SCX柱净化，HPLC-UVD测定。用C8柱分离，0.1mol/L碳酸铵-甲醇(80+20，v/v)和0.1mol/L碳酸铵-甲醇(20+80，v/v)为流动相，梯度洗脱，运行时间少于35min，检测波长为290nm。药物回收率在28%～117%之间，FBZ、OFZ、TBZ、TBZ-5-OH的LOD为5μg/kg。陈毓芳等建立了同时测定动物肾脏中OFZ、CAM、ABZ及FBZ等4种BMZs残留量的反相HPLC方法。色谱柱为DiscoveryC18柱，甲醇-0.02mol/L pH7.0磷酸二氢钾缓冲液(65+35，v/v)为流动相，等度或梯度洗脱，紫外二极管阵列检测器(PDA)检测，检测波长为294nm和316nm。方法LOD为0.01mg/kg；相关系数大于0.9999；在0.05～10.0mg/L的范围内的添加回收率为74.8%～90.25%，精密度为2.1%～7.3%。

杜红鸽等建立了动物肌肉组织中ABZ及其代谢物ABZ-SO、ABZ-SO2的HPLC分析方法。用乙酸乙酯提取肌肉组织样品中的药物，提取液浓缩后用酸性乙醇复溶，正已烷除脂，过HLB柱净化，以水-乙腈-0.1%甲酸为流动相，梯度洗脱，C18柱分离，UVD检测，检测波长为291nm。肌肉样品中平均回收率为86.4%，平均CV为1.96%，3种药物的LOD均为5ug/kg，LOQ均为20ug/kg。Hajee等在波长289nm检测了鳗鱼肌肉中MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH残留。用pH7.5的乙酸乙酯提取肌肉组织中的药物，加正已烷净化，再过氨丙基SPE柱，浓缩定容后，HPLC分析。用ChromSpher BLC柱分离，流动相为pH6.2的磷酸盐缓冲液-乙腈(7+3，v/v)，等度洗脱分析。该方法对MBZ-OH的LOD和LOQ分别为0.7μg/kg和1.1μg/kg，对MBZ分别为1.4μg/kg和2.3μg/kg，对MBZ-NH2分别为1.5μg/kg和2.1μg/kg；日间和日内CV均小于5.8%；MBZ、MBZ-NH2和MBZ-OH的平均回收率分别为90%、74%和92%。严寒等建立了猪肉中7种BMZs残留的HPLC方法。采用碱性乙酸乙酯提取，提取浓缩后用正已烷脱脂，经HLB柱净化，以乙腈-乙酸铵缓冲液为流动相，用ZORBAXEclipse Plus C18柱分离，进行梯度洗脱，UVD检测。该方法的平均回收率为60.3%～104.5%，LOD为7～12μg/kg。孙作刚等174采用HPLC-UVD测定羊肌肉组织中三氯苯唑及代谢物。用C18色谱柱分离，0.2mol/L乙酸铵溶液-乙腈(40+60，v/v)为流动相，检测波长296nm。三氯苯唑酮回收率大于78.3%，批内RSD小于4.6%；三氯苯唑回收率大于73.7%，批内RSD小于3.8%。

B.体液

Karlaganis等用pH11的氯仿提取血浆中的MBZ及内标物环苯达唑，HPLC测定时采用LiChrosorb SI60硅胶色谱柱分离，乙腈-饱和氯仿水溶液-甲酸(75+92.5+0.25，v/v)为流动相，等度洗脱，307nm波长处检测。MBZ及环苯达唑的回收率在70%-83%之间，MBZ在20～200ng/mL浓度范围内再现性的CV在3%～10%之间。Alvinerie等直接用乙酸乙酯提取血浆中的TCB、TCB-SO和TCB-SO2，离心，氮气吹干，复溶后供HPLC分析。色谱柱为硅胶柱，正己烷-乙醇-冰醋酸(500+50+0.6，v/v)为流动相，运行时间15min，UVD检测波长为215nm。三种化合物的回收率分别为89.5%、83.1%和82.2%，RSD分别为3.1%、3.5%和4.9%，方法的LOD为50ng/mL。Allan等用酸直接稀释血浆，过C18 SPE柱净化后，HPLC检测。色谱柱为LiChrosorb RP-8 C18反相柱，以甲醇-蒸馏水(55+45，v/v)和甲醇-0.05mol/L pH5.5磷酸铵溶液(55+45，v/v)为流动相，等度或梯度洗脱，UVD检测，检测波长254nm。MBZ及其主要代谢物的回收率大于80%，MBZ的LOD在等度洗脱时为20ng/mL，梯度洗脱时为10ng/mL。

Bogan等建立了一种测定体液中8种BMZs的HPLC-UVD方法。用磷酸缓冲液调节血浆pH7.4，再用乙醚提取，提取液在氮气下吹干后用甲醇复溶，HPLC测定。色谱柱为0DS-Hypersil C18柱，流动相为甲醇-碳酸铵混合液(65+35，v/v)，等度洗脱，运行时间为14min，检测波长为292nm。血浆和胃肠液中药物的LOD为20ng/mL，FBZ、OFZ和ABZ的平均回收率在70%～112%之间。Negro等建立了采用离子对色谱分离血浆和尿中TCB-SO和TCB-SO2的方法。采用蛋白沉淀和超滤方式从血清和尿样中提取TCB-SO和TCB-SO2后，注入C18色谱柱，流动相为pH7.0 的0.05mol/L磷酸缓冲液-乙腈(55+45，v/v)，再加入0.001mol/L癸烷磺酸钠，等度洗脱，UVD检测波长为312nm。TCB-SO和TCB-SO2在血清中的回收率分别为91.7%和91.6%，尿样中的回收率分别为90.3%和90.2%，两种代谢物在血清和尿样中的LOD均为10ng/mL。作者还对pH、有机试剂含量、直链烷基磺酸钠链长、离子对试剂对色谱的影响等进行了研究。

C.牛奶

De Ruyck等建立了牛奶中FBZ、TBZ、ABZ、OXI等药物的离子对HPLC方法。奶样中加入乙腈和乙酸乙酯后，用异辛烷除脂，再通过二氯甲烷LLP净化，HPLC测定。色谱柱为C18柱，0.01mol/L正辛烷磺酸钠正磷酸缓冲液(pH3.5)-乙腈-水为流动相，梯度洗脱，UVD检测，检测波长为295nm。方法平均回收率在68%～85%之间，LOD小于3.8ng/mL，LOQ小于6.9ng/mL，日内和日间CV小于12.7%。Macri等建立了牛奶中8种BMZs的HPLC-UVD残留分析方法。色谱柱为RP C18柱，流动相含有0.01mol/L戊烷磺酸盐和5%三乙胺(pH3.5)。方法LOD为10ug/L，回收率在63.4%±5%至97.0%±3%之间。Tai等采用HPLC双波长法测定了奶中FBZ、OFZ、TBZ和TBZ-5-OH残留。流动相为甲醇-pH7.0的磷酸铵缓冲液，TBZ和TBZ-5-OH采用Lichrosorb RP-18色谱柱(25cm×4.6mm，10μm)分离，流动相比例为(70+30，v/v)；FBZ和OFZ采用Hypersil ODS色谱柱(25cm×4.6mm，5μm)分离，流动相比例为(53+47，v/v)或Lichrosorb RP-18色谱柱分离，流动相比例为(40+60，v/v)，流速1.0mL/min。FBZ和OFZ在298nm波长处检测，TBZ和TBZ-5-OH在318nm波长处检测。FBZ、OFZ和TBZ在10ug/L添加浓度水平下的回收率大于等于80%，试验室内CV小于等于11%。Fletouris等建立了一种简单、快速、灵敏的HPLC方法定量追踪分析牛奶中10种BMZs。样品在碱性条件下用乙酸乙酯萃取蒸干，流动相再溶解，反相色谱分析。色谱柱为C18柱，流动相为含5mmo/L四丁铵的乙腈-0.01mol/L磷酸溶液(20+80，v/v)，等度洗脱，UVD检测，检测波长为292nm。在5.3～200μg/L浓度范围内，线性良好；除FBZ的LOD为40μg/L外，其他9种药物均小于10μg/L；平均回收率为79%～100%，RSD为2.0%～5.8%。

D.鸡蛋

Kan等建立了测定鸡蛋中FLU及其代谢物的HPLC-UVD方法。用0.1mol/L pH9.3的硼砂溶液溶解样品，乙酸乙酯提取三次，在蛋黄样品提取液中再加1g硫酸钠以减少乳化，60℃条件下，氮气吹干有机相，残渣用流动相复溶，再用异辛烷脱脂，过膜后，进HPLC分析。色谱柱为Purosphere RP-18柱，pH5.2醋酸铵缓冲液-乙腈(72+28，v/v)为流动相，等度洗脱，UVD检测，检测波长为250nm。鸡蛋中FLU的LOD为0.012mg/kg，其水解代谢物(FLU-HMET)的LOD为0.007mg/kg，降解代谢物(FLU-RMET)的LOD为0.028mg/kg；蛋白和蛋清中FLU及其代谢物的平均回收率均大于77.7%，RSD均低于10%。

2)荧光检测器(fluorescence detector，FLD)

A.组织

Shaikh等建立了选择性的HPLC-FLD方法，检测三文鱼、罗非鱼和鳟鱼肌肉组织的ABZ残留标示物。样品处理不需要SPE净化，直接HPLC分析。色谱柱为反相LunaC18柱，乙腈-甲醇-缓冲液为流动相，梯度洗脱，激发波长290nm，发射波长330nm。ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2和ABZ-NH2-SO2的LOQ分别为20μg/kg、1.5μg/kg、0.5μg/kg和5μg/kg，LOD分别为6μg/kg、1μg/kg、0.1μg/kg和2μg/kg，回收率分别大于82%、78%、75%和63%。Wilson等建立了绵羊、牛和猪的肝脏和肌肉组织中8种BMZs的HPLC-FLD分析方法。液相色谱分离柱为Whatman Partisphere C18(12.5cm×4.6mm，5um)，流动相为含有10mmol/L三乙胺的甲醇-NH4H2PO4缓冲液(53+47，v/v)，流速0.75mL/min，检测波长298nm，进样量20uL。8种BMZs的LOD均为50ug/kg；在100μg/kg的添加水平下，肝脏组织的平均回收率为92%，CV为8%，肌肉组织的平均回收率为88%，CV为5%。采用FLD检测时，可以大大减少干扰，简化净化环节，提高方法的回收率和重现性。

B.牛奶

Kinabo等建立了检测牛奶中TCB及其代谢物的HPLC-FLD方法。用丙酮提取奶样中的药物，提取液用等量水稀释后，过C18 Sep-Pak SPE柱净化，甲醇洗脱，HPLC测定。分析柱为ODS-Hypersil柱(10cm×5mm，5μm)，流动相为0.13mol/L pH6.7醋酸铵缓冲液-甲醇(30+70，v/v)，等度洗脱，流速1.5mL/min，FLD检测，激发波长300nm，发射波长676nm。对TCB-SO2、TCB-SO和TCB的LOD分别为20μg/L、40ug/L和40μg/L，回收率在76%～92%之间。Arenas等测定牛奶中的TBZ和TBZ-5-OH，将5mL奶样用浓盐酸在85～90℃酸解4h，释放出与硫酸盐结合的TBZ-5-OH，酸解物用NaOH调节pH8.0，然后用乙酸乙酯提取，提取物用PRS阳离子交换柱净化后，HPLC分析。色谱柱为PartiSphere SCX阳离子交换柱，流动相为0.05mol/L KH2PO4-ACN (20+80，v/v)，用磷酸调pH至3.8，等度洗脱，FLD检测，激发波长为308nm，发射波长为345nm。TBZ、TBZ-5-OH和与硫酸盐结合的TBZ-5-OH回收率分别大于87%、98%和96%，CV小于等于61%，LOQ为0.05μg/mL。

3)UVD与FLD串联

Su等建立了测定肌肉和肝脏组织中6种BMZs残留的UVD和FLD串联分析方法。研究发现290nm波长适合测定ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和TBZ，而TBZ-5-OH和MBZ更适合在320nm波长处检测；FLD检测法(激发波长290nm，发射波长320nm)适合测定ABZ-SO、ABZ-SO2、ABZ-NH2-SO2和TBZ，而TBZ-5-OH和MBZ不适合用FLD检测。该方法用pH10的乙腈提取肌肉和肝脏组织中的药物，加入BHT防止TBZ-5-OH氧化，提取物用C18柱净化，HPLC测定。分析柱为Cosmosil 5C18-MS-II柱，流动相为乙腈和0.02mol/L磷酸二氢钠(pH3.3)，梯度洗脱。UVD的LOD在0.005～0.03μg/mL之间，FLD在0.004～0.02μg/mL之间；回收率在71%～101%之间，日内和日间CV分别为1.92%和7.22%。Rummel等报道了用HPLC测定小鼠血浆中ABZ、ABZ-SO、ABZ-SO2、FBZ、FBZ-SO和FBZ-SO2的方法。小鼠血浆用碳酸钾使其呈碱性，再用乙酸乙酯萃取，将萃取液蒸发，重新溶解在流动相中，用反相HPLC分析，乙腈-甲醇-缓冲液作为流动相。FBZ及其代谢物用UVD在290nm下进行检测，ABZ及其代谢物用FLD在激发波长290nm和发射波长330nm检测。ABZ、ABZ-SO和ABZ-SO2的回收率分别为95%、82%和92%，FBZ、FBZ-SO和FBZ-SO2的回收率分别为64%、90%和94%，平均CV小于等于15%。